甲型禽流感病毒检测

禽流感（bird flu或avian influenza）是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，也能感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。禽流感的症状依感染禽类的品种、年龄、性别、并发感染程度、病毒毒力和环境因素等而有所不同，主要表现为呼吸道、消化道、生殖系统或神经系统的异常。

人有轻度直至严重的呼吸道症状，包括咳嗽、打喷嚏和大量流泪；头部和脸部水肿，神经紊乱和腹泻。禽流感的发病率和病死率差异很大，取决于禽类种别和毒株以及年龄、环境和并发感染等，通常情况为高发病率和低死亡率。在高致病力病毒感染时，发病率和病死率可达100%。1997年，香港H5N1型禽流感病毒感染导致12人发病，其中6人死亡。禽流感潜伏期从几小时到几天不等，其长短与病毒的致病性、感染病毒的剂量、感染途径和被感染禽的品种有关。禽流感是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一种从呼吸病到严重性败血症等多种症状的综合病症，目前在世界上许多国家和地区都有发生，给养禽业造成了巨大的经济损失。这种禽流感病毒，主要引起禽类的全身性或者呼吸系统性疾病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，发病情况从急性败血性死亡到无症状带毒等极其多样，主要取决于带病体的抵抗力及其感染病毒的类型及毒力。

禽流感病毒不同于SARS病毒，禽流感病毒迄今只能通过禽传染给人，不能通过人传染给人。感染人的禽流感病毒H5N1是一种变异的新病毒，并非在鸡、鸭和鸟中流行了几十年禽流感的H5N2。目前没有发现吃鸡造成禽流感H5N1传染人的，都是和鸡存在密切接触，可能与病毒直接吸入或者进入黏膜等原因造成感染。它可以通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。流感病毒有三个抗原性不同的型，所有的禽流感病毒都是A型。A型流感病毒也见于人、马、猪，偶可见于水貂、海豹和鲸等其他哺乳动物及多种禽类。

人类感染禽流感病毒的概率很小，主要是由于三个方面的因素阻止了禽流感病毒对人类的侵袭。首先，禽流感病毒不容易被人体细胞识别并结合；第二，所有能在人群中传播的流感病毒，其基因组必须含有几个人流感病毒的基因片段，而禽流感病毒没有；第三，高致病性的禽流感病毒由于含碱性氨基酸数目较多，使其在人体内的复制比较困难。文献中记录的最早发生的禽流感在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种疾病被更名为禽流感。禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握特异性的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。

禽流感是由甲型流感病毒引起的一种禽类疾病综合征。1997年5月，我国香港特别行政区1例3岁儿童死于不明原因的多器官功能衰竭，同年8月经美国疾病预防和控制中心以及WHO荷兰鹿特丹国家流感中心鉴定为禽甲型流感病毒A（H5N1）引起的人类流感。这是世界上首次证实流感病毒A（H5N1）感染人类，因而引起了医学界的广泛关注。

禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成。这8个片段编码10个病毒蛋白，其中8个是病毒粒子的组成成分（HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA），另两个是分子质量最小的RNA片段，编码两个非结构蛋白——NS1和NS2。NS1与胞质包涵体有关，但对NS1和NS2的功能目前尚不清楚。现在已经获得了包括H3、H5和H7在内的几个禽流感病毒亚型HA基因的全部序列以及所有14个血凝素基因的部分序列。

禽流感病毒一般为球形，直径为80～120nm，但也常有同样直径的丝状形态，长短不一。病毒表面有10～12nm的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。两种不同形状的表面钉状物是HA（棒状三聚体）和NA（蘑菇形四聚体）。禽流感病毒粒子由0．8%～1．1%的RNA，70%～75%的蛋白质，20%～24%的脂质和5%～8%的碳水化合物组成。脂质位于病毒的膜内，大部分为磷脂，还有少量的胆固醇和糖脂。几种碳水化合物包括核糖（在RNA中）、半乳糖、甘露糖、墨角藻糖和氨基葡糖，在病毒粒子中主要以糖蛋白或糖脂的形式存在。病毒蛋白及潜在的糖基化位点是病毒基因组特异的，但病毒膜的糖蛋白或糖类链的脂质和碳水化合物链的成分，是由宿主细胞确定的。流感病毒的抗原结构分为H和N两大类。H代表血细胞凝集素（hemagglutinin），有如病毒的钥匙，用来打开及入侵人类或牲畜的细胞；N代表神经氨酸酶（neuramidinase），是帮助病毒感染其他细菌的酵素。

流感病毒为了生存而不断发生变异，以逃脱动物产生的特异性抵抗力。人们为了预防禽流感也研制出了各种疫苗。但机体在产生特异性抗体后，病毒为逃脱机体的扑杀而不断地发生着变异，这样原有的抗体即失去作用，病毒就可使动物重新发病。因此就目前的防疫技术和手段而言，禽流感病毒是消灭不了的。

禽流感的病原体是甲型流感病毒的H5N1亚型病毒。1997年香港的禽流感与目前亚洲10个国家和地区发生的禽流感，病原体都相同。H5N1型禽流感病毒是人与动物共患的流感病原体，容易引起世界性大流行。由于病毒多变异，导致甲型流感反复发生，难以彻底根除。

禽流感病毒是囊膜病毒，对去污剂等脂溶剂比较敏感。甲醛溶液、β丙内酯、氧化剂、稀酸、乙醚、脱氧胆酸钠、羟胺、十二烷基硫酸钠和铵离子能迅速破坏其传染性。禽流感病毒没有超常的稳定性，因此对病毒本身的灭活并不困难。病毒可在加热、极端的pH、非等渗和干燥的条件下失活。在野外条件下，禽流感病毒常从病禽的鼻腔分泌物和粪便中排出，病毒受到这些有机物的保护极大地增加了抗灭活能力。此外，禽流感病毒可以在自然环境中，特别是凉爽和潮湿的条件下存活很长时间。粪便中病毒的传染性在4℃条件下可以保持长达30～50d，20℃时为7d。

病毒吸附在细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体上，然后通过受体介导的细胞内吞作用，病毒进入细胞。这包括暴露于核内体内的低pH，导致HA的构象改变介导膜融合。这样，核衣壳便进入胞质并移向胞核。流感病毒利用独特的机制转录。启动转录时，病毒的核酸内切酶从宿主细胞的mRNA上切下5′帽子结构，并以此作为病毒转录酶进行转录的引物。产生出6个单顺子的mRNA，并转译成HA、NA、NP和三种聚合酶（PB1、PB2和PA）。NS和M基因的mRNA进行拼接，每一个产生出两个mRNA，依不同阅读框架进行转译，产生NS1、NS2、M1和M2蛋白。HA和NA在粗面内质网内糖基化，在高尔基体内修饰，然后转运到表面，植入细胞膜中，HA需要宿主细胞蛋白酶将其裂解成HA1和HA2，但两者仍以二硫键相连，这种裂解可生成传染性病毒，并以出芽方式从质膜排出细胞。

禽流感病毒抗原性变异的频率很高，且主要以两种方式进行：抗原漂移和抗原转变。抗原漂移可引起HA和（或）NA的次要抗原变化，而抗原转变可引起HA和（或）NA的主要抗原变化。抗原漂移：抗原性漂移是由编码HA和（或）NA蛋白的基因发生点突变引起的，是在免疫群体中筛选变异体的反应，它可引起致病性更强病毒的出现。抗原转变：抗原性转变是当细胞感染两种不同禽流感病毒时，病毒基因组的片段特性允许发生片段重组，从而引起突变。它有可能产生256种遗传学上不同的毒力各异的子代病毒。

【检测原理】　甲型禽流感病毒抗原试验是一种薄膜免疫层析试验，利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测气管、口咽部和泄殖腔拭子标本中的甲型流感核蛋白抗原。该类抗体固定到一条膜上，形成三条不同的线，并与其他试剂／垫结合在一起，构成测试条。测试条置于书形检测卡中。拭子标本需要做样本处理，将拭子上的样本洗脱到转移介质或盐水中。将样本加到检测条的上端并将检测卡闭合。检测结果根据15min时紫红色检测线的存在与否来解释。在有效试验中蓝色对照线变为粉红色。

【适应证】　临床上怀疑为禽流感病毒感染的患者。

【标本采集】　气管、口咽部、泄殖腔拭子。

【操作方法】

1．标本处理。拭子：在0．5～3．0ml相应的液体转运介质中稍用力转动拭子以洗脱拭子。如果使用的是液体标本，直接进行检测。

2．拭子洗脱。①将拭子放入待测试管中，在液体中用力转动3圈；②将拭子在试管壁上挤压，将标本从拭子中挤出；③去除拭子；④用管中液体标本进行检测。

3．测试前从包装袋中将检测卡取出，平放在工作台上，做好标记。

4．用力挤压吸管顶端的球部，并将吸嘴放入标本中，当吸嘴在标本中时，松开球部，可将液体吸入管中。要确保管的底部没有气泡。

5．按箭头所示在检测条的顶端找到白色样品垫，将管中内容物（100μl）慢慢（逐滴）全部加到样品垫上使样品全部吸入样品垫中，不要将样品加到紫红色垫上。

6．立即从检测卡上揭去黏附衬。将检测卡密闭，15min时在窗口中读取结果。

7．读取结果时如有必要可将检测卡倾斜以减少结果窗口中的眩光。

【结果判读】

1．阴性　蓝色对照线（C）变为紫红色，无其他线出现。

2．阳性　蓝色对照线（C）变为紫红色，并在它上面另出一条紫红色的检测线（T）。只要有检测线，即使颜色很浅，结果也是阳性的。

3．无效　如果对照线（C）仍为蓝色或根本就没有出现，不管检测线（T）存在与否也不管阴性对照线（N）是否变为紫红色，试验都是无效的。对无效试验要换一个新的检测卡重新检测。

【参考范围】　阴性。

【临床意义】

1．患者发病前1周曾到疫点，与被感染者禽类及其分泌物、排泄物等有密切接触，提供了患病的可能性。

2．不同亚型的禽流感病毒感染人类后有不同的临床症状。有的为上呼吸道感染症状，有的亚型表现为结膜炎。重症患者患者一般为H5N7亚型病毒感染，且预后较差，住院病死率很高，截至目前，病死率高达55%。

【局限性】

1．阴性检测结果不能排除甲型流感病毒感染。因此甲型禽流感病毒抗原试验检测结果应与临床检查相结合以做出准确诊断。

2．甲型禽流感病毒抗原试验既能检测活的甲型流感病毒，也能检测死的甲型流感病毒。

3．试验性能与标本中的抗原载量有关，与细胞培养和PCR检查结果无必然联系。

4．标本采集量不足或标本的处理、转运不正确可产生假阴性结果。

5．血性标本对甲型禽流感病毒抗原试验不适宜。

【方法学优点】

1．简便、快速，15min即出结果。

2．此方法的敏感性以及特异性均较高，重复性非常好。