皮肤主要细胞的分离培养方法

一、基本方法

（一）标本来源和清洁消毒

来自自体和异体的细胞都可用来制作皮肤替代物。包皮是同种异体KC和Fb的主要来源。身体其他部位的皮肤活检标本是皮肤组织工程自体细胞的来源。整形术获得的头皮标本或通过拔毛获得的标本是研究毛囊细胞生物学的主要来源。

上述标本可保存在添加青霉素、链霉素的D－Hank液或DMEM培养基中24h，一般认为4h内进行细胞分离，可以较好地保证获得细胞的活力。

分离细胞的第一步就是清洁消毒标本。我们使用的方法是先用70%乙醇擦拭标本（也可用氯己定处理），再通过吸管或20ml注射器用含双抗的D－Hank液反复冲洗，每次5min，共5次。文献中有将标本放入小瓶中反复多次撞洗的报道。

（二）皮肤细胞分离方法

将组织分散成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。从组织中获得单细胞悬液的方法一般是酶分离。细胞暴露在酶中的时间要尽可能短，以保持最大的活性。下面是分离皮肤、毛囊细胞常用的消化方法。

1．胰蛋白酶消化法 将清洁消毒后的标本，去除不需要的组织，用无菌的手术刀和剪刀把需要的组织切成3～4mm宽的小片。加入溶解于无钙镁的平衡盐溶液中的0．25%胰蛋白酶，约每克组织加入10ml。在4℃孵育过夜（6～18h）。吸弃胰酶，用含10%牛血清的溶液或大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。用吸管轻轻吹散组织。以200目无菌不锈钢筛网过滤，获得单细胞悬液。计数后接种培养。常用于分离KC。

2．胶原酶消化法 充分冲洗的组织剪成3～4mm宽的小片，加入0．2%胶原酶D的DMEM溶液。37℃孵育2～6h。可加入3mmol／L CaCl2增加解离效率。通过无菌不锈钢筛网或尼龙网过滤细胞悬液。用DHank液或培养基重悬、离心清洗4～5次。培养基重悬细胞，计数后接种培养。常用于分离Fb、毛乳头等真皮成分细胞。

3．分离酶（dispase）消化法 充分冲洗的组织剪成3～4mm宽的小片，加入0．25%～0．5%分离酶PBS溶液，4℃孵育过夜。该方法主要用于将上皮部分与真皮部分分离，如将皮肤标本的表皮和真皮从基膜带分开；将头皮标本的毛囊间上皮部分与真皮部分、毛囊与周围结缔组织分离。获得的上皮部分一般还需要用胰蛋白酶或胰蛋白酶EDTA消化液进一步消化以分散细胞。过滤后通过平衡盐溶液多次离心清洗去除分离酶。培养基重悬细胞，计数后接种培养。

分离真表皮连接也可采用嗜热菌蛋白酶。

（三）传代方法

传代方法是指从原培养容器中分离、扩增细胞的技术。每一种细胞使用消化液的浓度和条件应该根据经验加以确定，所有操作必须保证细胞的活力。向培养瓶中加入清洗液、消化液都在对着细胞的一面进行。常用消化液多使用胰蛋白酶或胰蛋白酶EDTA溶液，一般方法如下。

1．细胞清洗 吸弃陈旧培养基后，用灭菌D－Hank液或PBS或EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸）溶液清洗细胞，前两者的目的是去除残余培养基中牛血清对胰蛋白酶消化效力的影响，后者可灭活滋养细胞、抑制Fb。

2．细胞脱壁 加入消化液的量以覆盖细胞层为度。37℃孵育1min至数分钟，显微镜下观察，细胞收缩、出现间隙即可终止消化，此时细胞未脱落，可直接吸弃消化液，加入中和液，吸管轻轻吹打，使细胞脱壁，离心、记数、分瓶培养。一些比较容易培养的细胞经验丰富时也可直接分瓶培养。另外，还可轻轻摇动培养瓶，使细胞完全脱落。细胞分离需要的时间因细胞种类不同而有所变化。应仔细监测分离过程，避免细胞损伤太重。

大量皮肤种子细胞是双层皮肤替代物商品化的前提。传代培养是获得大量细胞的必需途径。Fb分离、扩增比较容易。而KC的生命有限，经历约50次细胞分裂后将停止生长，体外能传5～6代。体外培养KC主要有2种方法，即有血清滋养细胞培养法和无血清无滋养细胞培养法。前一种方法培养的KC有比较明显的分化，最广泛用于制备移植用的表皮膜；后一种方法最适宜于KC生物学特性研究（可避免血清中存在的或滋养细胞产生的未知因子的影响）。用于制备双层组织工程皮肤的KC应在扩增的同时减少分化，保持相对旺盛的增殖能力，故一般用第二代细胞。通过冻存建库，可使用于制备双层组织工程皮肤的细胞数量充足，这对商品化和生产规范化都是必要的，并便于细胞纯度和安全性检测。细胞纯度对移植结果的一致性和是否产生免疫反应都有重要影响。

二、人包皮成纤维细胞的分离、扩增

（一）包皮成纤维细胞的原代分离培养方法

1．组织块法 清洁消毒包皮后，表皮面向下置于培养皿中，眼科剪修去疏松结缔组织，D－Hank液充分冲洗去除血细胞。眼科剪剪取表皮下真皮组织，约1mm3大小。针灸针或骨穿针将组织块送入25ml培养瓶底，间距5～10mm。待组织块贴牢后，加入适量含10%胎牛血清、双抗的DMEM培养基，以刚淹没组织为度。24h后再添加新鲜培养基2ml。以后每3d换液一次。注意动作轻柔，换液操作均在组织块对面进行。

2．消化法　将清洁消毒、修剪后的包皮标本剪成0．3cm×2cm的皮条，加0．25%分离酶浸没组织，4℃冰箱中消化16～18h，用眼科镊揭下表皮，剩余的真皮成分剪成糊状，加0．2%胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化4h左右，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度。加D－Hank液以每分钟1 200转离心5min，共5次，以洗去胶原酶。弃上清，沉淀即为Fb，加含10%胎牛血清、双抗的DMEM培养基重悬，接种至25ml培养瓶中，3d后更换培养基。

（二）包皮成纤维细胞的传代扩增方法

吸弃培养基，D－Hank液轻洗以去除残余牛血清。加0．25%胰蛋白酶溶液刚淹没细胞，显微镜下观察，细胞收缩、出现裂隙即翻转培养瓶，去胰蛋白酶，含10%胎牛血清的DMEM中和，轻轻吹打使细胞脱壁，1∶2分瓶培养。

平滑皮肤部位来源标本的Fb分离培养方法与包皮的基本相同。Fb呈梭形，旋涡状生长（图28－1，图28－2）。抗结蛋白单克隆抗体和肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色呈阴性，抗波形蛋白单克隆抗体呈阳性。

图28－1　头皮Fb（×100）

图28－2　包皮Fb（×40）

三、角质形成细胞的分离、扩增

（一）角质形成细胞的分离方法

1．组织块法培养KC　皮肤标本乙醇搽2遍、彻底冲洗5遍，用弯剪剪除皮下组织、0．25%氯己定浸泡5min、漂洗2遍后，剪成1mm×1mm，接种在涂过2%明胶的培养瓶（皿）底，间隔2～5mm，晾干0．5～2h，加培养基3～4mm深度即可。培养基可用完全FAD培养基，近汇合时用胰酶消化成单细胞悬液，换MCDB153＋重组人表皮生长因子0．1μg／ml、胰岛素5μg／ml、氢化可的松0．5μg／ml＋氯化钙0．3mmol／L培养。该法常混有成纤维细胞的污染，应注意清除。

2．酶分离法　分为一步消化法和两步消化法。前一种方法最常使用0．25%胰酶，直接从皮肤上分离单个KC；后者先使用分离酶分离表皮，获得的表皮继续用胰蛋白酶EDTA消化。有研究认为，直接从真皮上分离KC的方法导致混杂Fb比先分离表皮的方法高2倍，会混有0．5%～4%的Fb。

（1）一步胰蛋白酶消化法：清洁消毒后剪成小片段的标本，用0．25%胰酶消化4℃消化过夜（16～18h）。终止消化后揭下表皮部分，轻轻吹打，将其分散成单个细胞，200目筛网过滤，每分钟1 500转离心5min，弃上清，加培养基重悬，台盼蓝活细胞计数后接种。1cm×1cm皮肤活检标本约可获得3× 106个细胞，其中只有1%的基底细胞和黑素细胞可以形成克隆生长，因此原代平皿培养的效率很低。新分离KC的接种密度2．67 ×104个／cm2。

（2）两步酶分离法：用0．25%分离酶（dispase）或0．17%胰蛋白酶或0．5%嗜热菌蛋白酶（thermolysin），4℃冰箱中消化清洁的皮条16～18h，从真皮揭下的表皮，用0．05%胰酶、0．01%EDTA于37℃孵育0．5～1h（不同试剂厂家、不同实验室可能有较大差异，笔者常用的是0．125%胰酶0．1% EDTA，也可只用0．25%胰酶）。终止消化后，吹散组织使成单细胞悬液。过滤、离心、记数、接种同一步胰蛋白酶消化法。

（二）培养方法选择

1．滋养细胞有血清培养　一般用人Fb制备的滋养细胞或鼠3T3细胞上培养KC。基础培养基为完全FDA培养基，即DMEM培养基（75%）、Ham F12培养基（25%），添加物有胎牛血清（10%）、腺嘌呤24μg／ml、表皮生长因子10ng／ml、氢化可的松0．5ng／ml、胰岛素5μg／ml、霍乱毒素6ng／ml、转铁蛋白10μg／ml、三碘甲状腺原氨酸1．3ng／ml。

2．KC无血清培养　基础培养基为MCDB153，添加物分别有表皮生长因子10ng／ml、牛垂体提取物140μg／ml、氨基乙醇6μg／ml、磷酸氨基乙醇14μg／ml、氢化可的松500ng／ml、胰岛素5μg／ml、氯化钙1× 10－4 mol／L。也有添加转铁蛋白10μg／ml的报道。另外，还有市售现成无血清培养基可供选择，如K－SFM、Epilife、KGM等，以KSFM较常用。添加物的量在不同的文献报道中可能有细微的差别。

（三）培养基中影响KC体外生长和分化的因素

1．生长因子和激素 EGF和胰岛素是克隆生长必需的，EGF不诱导进入S期；当克隆较小时不影响KC生长；总之，EGF不增加KC生长速率。但当生长克隆中心细胞开始分化和层化时，添加EGF对KC迁移有潜在效应，克隆边缘伸展和变平。EGF通过增加开始终末分化增殖细胞间的距离来增加分裂KC和培养寿命。氢化可的松影响克隆大小的形式（调节克隆均匀规则生长，在传代培养中有助于KC分层和分化）。霍乱毒素与IGF－Ⅰ（高浓度胰岛素也可能通过IGF－Ⅰ受体）、异丙肾上腺素、甲基异丁基黄嘌呤是已知的增加细胞cAMP水平、增加小细胞比例和显著增加细胞生长速率的试剂。滋养细胞（以3T3－J2细胞和人成纤维细胞为好）分泌的可溶性因子之一就是IGF－Ⅰ。另外，血管活性肠多肽在无EGF时，可通过特殊受体刺激腺苷酸环化酶诱导培养人KC增生。

2．水和添加物及所用材料（瓶、滤器等）的纯度 它们影响该培养基的质量。其中正确选择2种成分的浓度能够抑制Fb的生长：腺嘌呤（比正常Fb最适生长需要高20倍）；钙离子（0．3mmol／L，远低于Fb需要的水平）。有人认为氨基乙醇和磷酸氨基乙醇可合成磷脂，其相对高浓度是KC生长必需的，但也有人认为KC对它们不存在质的特殊需要。牛垂体提取物在促进原代和长期培养的KC生长上是高效的，不刺激Fb增生和KC终末分化。转铁蛋白是次要的添加物，其纯度不理想，如果基础培养基的铁离子和锌离子浓度相应增加，可省略。

3．钙离子的作用　钙离子在KC的生长和分化中起重要作用。最重要的钙依赖功能是形成桥粒，与这些离子的浓度成正比。体外无钙离子则无桥粒形成。有人认为这是调节表皮层化和分化的关键步骤。MCDB153中钙离子浓度的变化会导致KC表型的变化。在钙离子浓度为0．3mmol／L时生长速率最大，中间丝和角质透明颗粒开始出现。在低钙离子浓度（0．03～0．1mmol／L），当钙离子浓度下降时缺乏层化，细胞扁平、数量逐渐减少、分化更少。在高钙离子浓度（1mmol／L），层化和分化出现。因此，KC分化可简单通过钙离子浓度变化来调节。

4．气液界面培养 在空气－液体交界面培养KC，可获得完全分化的表皮。浸没培养并不是KC的生理生长环境，为了获得更接近KC生长的生理条件，人们建立了空气－液体交界面培养法。其基本原理是在底物上培养KC，并在空气－液体交界面进行培养KC。该方法培养的KC在许多方面可形成类似表皮的复层组织。目前常用的底物有正常人去表皮真皮、胶原基质（有或无NHF）、各种成分的人工真皮等。在底物上接种KC后，浸没培养过夜或数天。然后降低培养基的液面，使培养物在空气－液体交界面处继续培养，培养基可根据需要选择，每隔2～3d换培养液1次。Ca2＋浓度一般为正常浓度或高于正常浓度。

（四）培养的具体步骤

1．滋养细胞有血清培养法 主要的步骤有成纤维细胞滋养细胞的制备、接种新分离的KC、传代。

（1）成纤维细胞滋养细胞的制备：用60Gyγ射线照射合适数量的贴壁生长的或悬液中的Fb。次选丝裂霉素C处理。取一瓶80%以上亚融合生长的人Fb，吸去培养基；加入5ml含8μg／ml丝裂霉素C的含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2孵箱处理5h；吸去处理液，DMEM洗3遍；每瓶加入2ml胰酶，倒置显微镜镜下观察，细胞收缩出现裂隙即翻转培养瓶，倾去胰酶，每瓶加入3ml DMEM培养基，轻轻吹打使细胞脱壁，取1ml台盼蓝染色，血细胞记数板记数；5×103个／cm2接种备用，置37℃、5%CO2孵箱培养，每3d换液一次。1个月内随时可用。处理成功标志为细胞不再增生，体积明显扩大，铺展生长（图28－3）。

（2）接种新分离KC：按（3～5）×104个／cm2接种新分离的KC。完全FAD培养基培养，每天换液一次。

图28－3　丝裂霉素C处理包皮FB获得的滋养细胞（×400）

（3）传代：吸弃培养基，清洗后，先用0．05%EDTA溶液孵育30min左右以灭活滋养细胞。之后加入0．125%胰蛋白酶0．1%EDTA混合消化液于培养瓶中，37℃消化3～10min，当细胞变圆、细胞间隙增大，并有脱落趋势时，用含血清DMEM培养基终止消化，每分钟1 000转离心5min，反复2遍，以洗去EDTA，加入FAD培养基，吹打、分散细胞，制成细胞悬液，记数、分瓶培养。

KC呈克隆生长，滋养细胞逐渐被挤压在培养器皿的边缘或克隆细胞团之间，10d左右可汇合（图28－4）。

图28－4　滋养细胞有血清培养法培养的KC

2．无血清培养法 比有血清培养法步骤简单。

（1）接种KC：可在培养瓶底预先涂Ⅰ型鼠尾胶原或牛胶原，甚至Ⅳ型胶原溶液。按（3～5）×104个／cm2接种新分离的KC。KSFM等无血清培养基培养。隔1～2d换液一次。

（2）传代：细胞约70%融合后，加入0．125%胰蛋白酶0．1%EDTA混合消化液于培养瓶中，37℃消化3～10min，当细胞变圆、细胞间隙增大，并有脱落趋势时，用含血清DMEM终止消化，每分钟1 000转离心5min，反复2遍，以洗去EDTA，加入K－SFM培养基，吹打使细胞脱壁，记数、分瓶培养。一般情况下，5～7d后可再传代。

KC呈多角形，铺路石样生长（图28－5，图28－6）。角蛋白免疫组化染色呈阳性。

图28－5　K－SFM培养的包皮KC（×100）

图28－6　K－SFM培养的包皮KC（×400）

（五）角质形成细胞的冻存与复苏

用0．125%胰蛋白酶、0．1%EDTA混合液2ml消化、分散接近长满的单层的KC，每分钟1 000转离心5min，去除上清，反复2次，将细胞重新悬浮于KC培养基中，加入无菌的二甲亚砜至终浓度为10%，混匀后置于塑料冻存管内密封，逐渐降温，于－196℃液氮中保存。复苏时，将细胞从液氮中取出，迅速置于37℃的水浴内。融化后，每分钟1 500转离心5min，去除上清，加入新的KC培养基，重新悬浮后再离心1次即可继续培养。台盼蓝活细胞计数后接种培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。