培养用具的清洁

一、实验室对培养器皿清洁度的要求

组织工程所涉及的细胞培养工作需要使用大量的器材。在消毒使用前，绝大多数器材需要进行清洁。在资金雄厚或者要求特别的实验室，很多的器材已倾向于一次性使用，但从节约的角度来说，反复使用各种器材，包括玻璃器皿及一些塑料器皿（如培养瓶），在情理上都是可行的。

培养器皿（如玻璃器皿）上的微量重金属和其他有毒物质很难去除，只有在培养的细胞或者组织逐渐衰退时才会察觉出他们的影响，这说明不同的物质一定要清洗干净。尽管仪器的污染程度可能很低，但组织细胞培养用玻璃器皿的清洁要求显然高于普通用途的玻璃器皿，因此要使用特殊的清洁剂。随着来自各方面充足的资助，现在越来越多的实验室开始使用一次性的塑料培养瓶培养细胞，各种细胞的单层贴壁生长技术已经成熟。但如果涉及生产细胞或者组织产品，任何一个环节可能存在的内毒素污染都要尽量避免。因此，为避免化学物质污染培养基，或者剩余试剂和不需要成分的污染，需要对培养所涉及的器皿进行彻底的清洁。

二、培养器皿的种类

组织细胞培养的器皿种类繁多，功能独特，按照材质的不同可分为玻璃器皿、塑料器皿、金属器皿等。玻璃器皿包括玻璃量杯、吸管、培养瓶、培养皿及用来盛放培养液的玻璃瓶等；塑料器皿包括培养板、培养瓶、培养皿、吸头、滤器；金属器皿包括组织分离培养的所需的尖刀、镊子、不锈钢滤器等器械。

培养器皿按照利用重复性的不同还可分为一次性器皿、可重复利用器皿等。其实，这种分类方法也是相对的。有的实验室从本着节约的要求出发，将许多一次性培养器皿如培养板、培养瓶，经过重复的清洁消毒，而可以反复利用。

三、培养器皿的清洁

清洁的器皿包括用于分装和储存培养基及用于培养细胞的玻璃器皿，以避免残余的有毒物质污染内表面并且混入培养基，影响细胞的生长。如果玻璃器皿内表面用于细胞黏附生长，除了严格的清洁之外，还应带有相应的电荷。具有腐蚀性的碱性清洁剂会腐蚀玻璃器皿的表面不利于细胞贴壁，需要用稀盐酸或者硫酸进行中和。现在使用的许多清洁剂不会改变玻璃器皿的表面电荷，并且能完全去除。

此外，用来盛装清洁剂的浸泡缸或者浸泡槽应当有足够的深度，以便所有的玻璃仪器在浸泡时能够全部淹没入浸泡液中。浸泡缸的尺寸以600mm×400mm×300mm为宜。

（一）清洁液的准备

1．传统清洁液　传统清洁液主要由3种成分即浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。经过清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可以完全被清除。主要的清洁液有：①1%或2% NaOH溶液。分别称取10g或20g NaOH溶于1 000ml蒸馏水中。②1%或5%HCl溶液。分别量取10ml、50ml分析纯HCl溶于990ml、950ml蒸馏水中。③弱酸溶液。重铬酸钾100g、浓硫酸100ml、蒸馏水1 000ml。④次强酸溶液。重铬酸钾120g、浓硫酸200ml、蒸馏水1 000ml。⑤强酸溶液。重铬酸钾63g、浓硫酸1 000ml、蒸馏水200ml。

清洁液中最常使用的是次强酸溶液。清洁液本身具有强腐蚀作用，因此在配制及使用时要十分小心，操作人员要经过专业培训。其配制时应注意：①严格防护，戴手套和眼罩；②按配方称量重铬酸钾，将其完全溶于蒸馏水中；③再按配方把浓硫酸缓慢加入其中，边加边搅；④自然冷却、备用。配制清洁液的容器应防酸、耐热、有较大开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品盛装。新配制的清洁液是棕红色，使用时间过久后颜色变暗变绿，应弃去（深埋地下）并重新配制。

2．其他清洁液　除了重铬酸钾清洁液外，已有数种新型清洁剂问世，并且广泛应用于医药行业。如5%强力洗消精、5%洁消精，他们具有无毒、无害、无三废、无腐蚀及去热原、高效杀菌等特点。三效热原灭活剂是一种具有消毒、去污、热原灭活的高效洗涤剂，能够对所有器皿进行灭活消毒。在使用浓度下无毒、无腐蚀性，具有较高的消毒、去污、热原灭活的效应作用。大型细胞培养室要求所生产细胞产品中的内毒素须达到国家生物制品要求的范围，因此还要进行内毒素的清除工作，相应的清洁要求也更高，除了要进行常规清洁外，还要彻底去除内毒素，三效热原灭活剂在这方面具有较好的效果。

（二）清洁方法

所有新的仪器和材料都需要进行清洁处理，但这并不意味着各种器皿都适宜用同一种清洁方法。金属器皿（如钢、铝、铜等制品）在清洁剂中会被腐蚀，应当直接通过手工清洗，然后漂洗晾干。需要强调的是，用过的物品在干燥之前应用自来水冲洗，并放入清洁剂中浸泡。

1．玻璃器皿的清洁　玻璃器皿是经常重复使用的细胞培养用具。要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质，包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。新购的器皿表面呈碱性，使用前需先用自来水刷洗，然后用5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿可能附有大量蛋白质和油脂，使用后应立即浸入清水中备刷洗。用洗涤剂和软毛刷刷洗，不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。刷洗后的玻璃器皿洗净、晾干，酸缸浸泡，时间不能少于6h。刷洗和浸酸后的器皿必须用水充分冲洗，手工洗涤器皿时，每件器皿至少重复“注满水－倒空”15次以上，最后用双蒸水浸洗2～3次，烘干消毒后备用。

2．塑料制品清洗　使用器皿后立即用流水冲洗，浸入自来水中过夜，用纱布或棉签在50℃清洗液刷洗，流水冲洗、晾干，浸于清洁液中15min，流水冲洗（15～20遍），蒸馏水浸洗3次，双蒸水中浸泡24h，晾干备用。

3．橡胶制品的清洁　主要步骤：①自来水冲洗；②1%NaOH煮沸1h；③自来水冲洗3遍以上；④1%HCl浸泡30min；⑤流水充分水冲洗15～20遍；⑥蒸馏水漂洗3次；⑦超纯水漂洗1次；⑧80℃烘干；⑨高温高压消毒（温度128℃，时间25min）；⑩80℃烘干备用。

4．小塑料滤器的清洁　主要步骤：①先将其拆解开，自来水冲洗3遍以上，特别注意清洗橡皮圈；②晾干后，2%NaOH浸泡过夜；③自来水冲洗3遍；④5%HCl浸泡30min；⑤流水充分水冲洗15～20遍，蒸馏水漂洗2次；⑥超纯水漂洗2次，晾干；⑦高温高压消毒（温度128℃，时间25min）；⑧80℃以下烘干备用。一次性塑料器皿重复使用时，应立即浸入水中，自来水冲洗，洗涤剂清洁干净，滤干后浸泡于清洁液中过夜，自来水冲洗，用棉签反复擦洗多遍，然后蒸馏水清洗干净，60℃烤干备用。

5．金属器械的清洁　主要步骤：①自来水冲洗3遍；②毛刷刷洗3遍；③蒸馏水清洗2遍；④烘干；⑤高温高压消毒（温度128℃，时间25min）；⑥100℃烘干备用。

（三）其他清洗方法

除了以上的清洗方法外，还有其他的方法可以选用，如超声波清洗机、洗瓶机等。如国产的KQ－42003Y型医用数控超声清洗机可以对金属器械进行清洁，能够达到清洗干净、清洗效果稳定的效果，避免了人工操作时对工作人员产生的潜在危害，提高工作效率。

尽管清洁液的方法选择多样化，但是不同的清洁剂及不同的清洗方法在浸泡时间、清洁程序方面是不完全相同的。除了上述提到的具体内容之外，更详尽的细节要参考清洁剂或设备的使用说明书。

四、清洁后的保存

清洁、干燥完培养组织细胞的器皿后，在消毒前必须对清洁好的器皿进行包装，以便消毒、储存，同时也可防止落入灰尘及消毒后再次被污染。一般用锡纸、牛皮纸、棉布等做包装材料。也可将较小的器皿放入铝饭盒内，然后进行消毒。但应注意，如离心管及塑料盖，最好放在隔有数层纱布的金属消毒盒内进行消毒，以免塑料因接触高温金属而变形。金属器械则可直接放入铝饭盒内。