深低温保存技术

深低温保存技术中冷冻保存是组织细胞保存最常用的方法之一，它一般是指在0～－196℃进行保存，虽然实验者应用的温度在此范围内各不相同，但主要有－20～－40℃冰箱保存、－60～－80℃深低温冰箱保存和液氮（－196℃）超低温保存等。目前，冷冻保存在组织工程产品的保存中有较多的研究和应用。组织工程产品的玻璃化保存方法目前还在研究中，而干燥保存方法只是一种设想。

一、组织工程支架的冷冻保存

组织工程支架材料是组织工程学研究的重要内容之一。理想的组织工程支架材料具备以下特性：有良好的生物相容性；有组织再生引导性、诱导性或者生物活性；与组织再生同步的可降解性；降解产物和磨损或溶蚀颗粒无毒性反应；理想的表面特性及较高的孔隙率；与宿主组织匹配的力学特性。组织工程支架材料的保存应不破坏其上述特性。为此，组织工程支架材料的保存通常采用冷冻干燥的方法。由于冷冻干燥技术可以保持支架的原有形态、颜色和主要的生物活性物质（酶、蛋白等）；干燥过程在低温条件下进行，有效地保存了支架材料的降解性能；干燥过程有助于材料分子之间的交联，从而改善支架的理化性能；而且干燥后的支架重量轻，便于运输和贮存；支架含水量低，封存后不易污染、不易变性、吸水性好，可以在4℃或常温下长期保存等优点，因此，在组织工程研究和开发中备受重视。

冷冻干燥是使冷冻物质中的水分或其他蒸气压力较高的物质，在低温真空系统中进行升华而使支架材料本身干燥。要求有低温和真空设备；有效的加热设备和控制加热的方法。冷冻干燥的基本过程如下。

（一）预冻

冷冻干燥之前，将支架放在低温下冻结起来的过程即预冻。其目的是尽快停止或减少支架材料本身的生物化学变化，并使预冻好的支架在减压时不致产生泡沫和沸腾，避免悬液溢出或冲出。预冻后的支架材料物质结晶非常细小，结晶与结晶之间的空隙增加，干燥时的表面也相应增大，干燥的进程加快；干燥后的支架成为多孔状，这不但增加了表面积，而且还增加了毛细孔中的吸力，因此吸水性特别好。

（二）真空干燥除水

在真空状态下冰产生的水蒸气必须以可靠的方法除去，以便干燥进程顺利进行。常用的方法是低温冷凝水蒸气法，即在冷冻干燥时，将逸出的水分用很冷的表面来凝集。冷凝表面的温度与被干燥支架材料表面温度的梯度愈大，则干燥的速度愈快；冷凝的表面积愈大则效力愈高；一般冷凝水蒸气冷冻的厚度以不超过1．5cm为限，再厚则传冷效力降低，冷凝水蒸气的效果较差。

（三）真空度测定

一般将干燥过程分为2个阶段。第一阶段将支架材料的大部分水升华；第二阶段除去支架材料中的残余水分，使支架达到最低的含水量。在第一阶段中，由于一定温度时冰的水蒸气压已有一定的真空度，再提高真空度反而易使冷凝表面的冰蒸发，其水分将污染油泵，因此其真空系统内的真空度多少为冷凝表面的温度所限制。这就需要第二阶段的干燥来降低支架材料中的水分。真空度的测量由装在冷冻干燥机上的真空传感器探测。

（四）干燥加热

为加速干燥过程，使被干燥支架的水分不因蒸发时吸收热量降低支架本身温度而影响水分的进一步蒸发，所以在干燥到一定程度时要适当加热。冷冻支架中的水分在真空系统中不断蒸发需要热，这种热就是冰在该温度由固体变成气体所需要的热能。要求将此热能加于支架表面，使支架中的冰晶不致融化而干燥的速度又可达到最快。现有的多数冻干机采用电热方法直接加热支架容器并控制加热的温度。

（五）残余水量及其测定

干燥支架中的残余水量是衡量其质量的重要标志。残余水量愈低，贮存的时间愈长，反之则贮存时间愈短，支架愈容易繁殖微生物和变质。对组织工程支架，其最终含水量要求低于5%。在第二阶段干燥时，要提高其真空度，使真空度达到最佳最高状态；同时适当且安全地加热，并延长第二阶段干燥的时间。残余水量的测定方法，通常是取一定重量的干燥支架，进行烘干，称重量至恒重，计算失重的百分比，即为残余水量。

二、含活细胞组织工程皮肤的冷冻保存

（一）组织工程皮肤冷冻保存的方法

组织工程化组织就是有活性的细胞与可降解支架材料在体外构建的具有生命的组织。其最大特点是具有生命的体内植入材料，既不同于一般的细胞、组织和器官，又不同于一般的“无生命”的医用生物材料；其植入体内具有修复组织缺损并具备相应的功能。因此，组织工程化组织的保存是一个全新的课题。一般而言，保存组织工程化组织的关键是保存其中的细胞活性与功能、细胞与支架材料特异性黏附及支架材料的生物力学性能。在冻存和复苏过程中，细胞和细胞外基质间的物质和热量传递起着非常重要的作用，必须建立相应的理论模型。

由活细胞和生物相容性材料制成的组织工程皮肤是第一种获得美国FDA批准的组织工程产品。尽管组织工程皮肤形式多种多样，但它们的构成大致包括2个部分，即培养的种子细胞和各种材料来源的支架。目前对组织工程化皮肤采取的保存方法主要还是冷冻保存，因而细胞冷冻损伤的预防是关键，在降温与复温速率及冷冻保护剂的含量和配方的选择仍是重要环节。Harriger等将培养的人KC和Fb与胶原－糖胺聚糖海绵制备成活皮肤替代物，在富含脂质的培养基中添加100g／L二甲亚砜、200ml／L胎牛血清组成冻存液，1～20℃程控降温至－196℃保存，应用时置于37℃水浴中快速复温，发现冷冻保存的皮肤替代物表皮显著损伤，活力下降，移植后修复创面的能力明显下降，说明冷冻保存皮肤替代物的方法需要改进。Kuroyanagi等将Fb接种在胶原支架上所制成的组织工程真皮，用100g／L二甲亚砜和200ml／L胎牛血清作为抗冻剂，先置入－85℃低温下1d，然后置入－152℃低温下保存，在应用时37℃快速复温，发现Fb的活力达到80%，并在包括深及真皮的烧伤和皮肤缺损等创面中应用取得极好的效果。在多种组织工程化组织的冻存研究中报道的均是快速复温，复温水温大致在37～45℃，Wilkins等报道的组织工程皮肤融冻复温水温为37℃。Dermagraft－TC是一种暂时覆盖的合成类人工真皮，其内层由尼龙网构成支架材料，表面用硅膜做“表皮”，源于新生儿包皮的异体Fb种植在尼龙网孔内。网架内的Fb在支架内繁殖，分泌胶原、氨基多糖、生长因子等基质成分并埋于基质中，这种真皮替代物可在－70℃低温下长期冷冻保存，应用时在37℃水浴中迅速复温，它的效果等同或超过异体冻存皮，且不具有免疫排斥反应。但这种方法处理的产品并无活Fb存在，只是保存了Fb分泌的细胞因子和基质。Dermagraft也是一种合成类人工真皮，它使用可降解的聚羟基乙酸作为真皮支架，将异体第4～8代Fb种植在网架内，移植后支架成分逐渐被降解，种植的Fb则产生新的真皮基质。冷冻保存有效时间为半年。Gath等采用冷冻保存在－80℃的Dermagraft来修复肿瘤切除术后口腔内缺损，11d后所有缺损得到修复。Apligraf是真正意义的组织工程皮肤，其胶原蛋白胶由牛肌腱胶原提取，内含有人新生儿包皮纯化培养的Fb，表面种植KC，类似皮肤的双层结构。Apligraf无论从形态、生物化学及代谢方面均类似于人类皮肤。因其缺乏朗格汉斯细胞，不会引起受体的免疫排斥反应。创面移植后，两种细胞继续增殖，Fb对胶原蛋白胶基质进行改建，KC逐渐生长分化，形成多层分布的表皮层，使创面获得功能与结构类似正常皮肤的良好愈合。有报道，Apligraf制备后可置于高含量的混合冷冻保存液中快速冷冻，保存在液氮的气相中，应用时置于37℃水浴中快速复温，临床应用显示具有良好的活力和形态。但在实际销售中，它是用基于琼脂糖固体培养基保存的，保存时间为5～10d。

（二）组织工程皮肤冷冻保存需解决的问题及展望

组织工程皮肤的研究和开发是目前研究的热点。种子细胞的冻存是以保存其活性和功能、尽量降低冷冻保护剂毒性为目的的；支架材料的冻干则是保存其理化特性和生物活性；组织工程皮肤冻存的关键是保存其中的细胞活性与功能、细胞与支架材料特异性黏附作用以及支架材料的生物力学性能。目前，种子细胞和支架材料的冻存方法已基本成熟，但组织工程皮肤的冷冻保存技术仅限于个性化、小规模的应用，停留在研究和实验室水平。要真正形成产业，必须解决组织工程皮肤的保存问题，建立标准化的保存方法。因此，冻存技术将在组织工程皮肤研究与开发中发挥重要作用。要真正实现组织工程皮肤的长期保存，必须解决以下几个问题：①建立相应的数学模型来表征冻融过程的相位变化、跨膜热传导和多种成分的物质扩散与传递，以便精确计算深低温保存液中各种组分的含量和降温速度；②搞清冻存对细胞－细胞、细胞－细胞外基质间相互作用及对细胞活性和功能的影响；③建立冻存对细胞生物学活性和功能影响的生物学检测方法；④确定多种冷冻保护剂深低温保存的有效性，建立相关标准体系。

但从目前报道的文献看，传统的冷冻保存技术对仅含Fb的真皮替代物的保存效果勉强令人满意，而对含活细胞的双层组织工程皮肤的保存效果不容乐观，该方法对表皮的损害似乎无法避免，可能还需要寻找更合适的技术方法。

三、组织工程皮肤的玻璃化保存

玻璃化保存法似乎是组织工程产品较理想的深低温保存方法。它是指将用深低温保存液平衡后的细胞或组织直接由0℃以上温度浸入液氮中保存，含高含量冷冻保护剂的液体在快速降温过程中，黏滞度升高，液体分子的弥散运动被抑制，液体固化为一种类似于玻璃的非晶体状态，从而避免了细胞内外冰晶形成所致的损害。理论上，组织细胞的玻璃化保存不会出现化学性损伤和细胞内外物理性损伤。玻璃化保存法的实施是使出现玻璃化的温度高于液体的冰点。在由冷冻保护剂和盐、水组成的玻璃化溶液中，随着冷冻保护剂浓度的增加，玻璃化温度上升，而冰点则下降；当冷冻保护剂浓度增加到一定程度时，玻璃化状态也就能实现。但是，高浓度的冷冻保护剂对组织具有潜在的毒性反应，而且这种毒性反应与冷冻保护剂浓度和温度密切相关。因此，用玻璃化法冻存组织细胞的关键是在可形成玻璃化状态的前提下，尽可能选择较低的冷冻保护剂浓度，以减小冷冻保护剂的毒性反应，并仔细控制好整个玻璃化保存过程的操作环节，达到保存组织细胞结构和功能的目的。

科学家对多种成分、不同组方的玻璃化保存液进行了研究。目前报道的玻璃化保存液主要由2或3种以上的渗透性抗冻剂与非渗透性抗冻剂［糖和（或）聚合物］组成，液氮保存，成功保存了关节软骨、皮肤、心肌、组织工程血管、组织工程肝和组织工程胰腺。最知名的是M22玻璃化保存液由10余种成分的低温保护剂组成（表22－2），成功实现肾脏的玻璃化保存，复温后移植成功。虽然复合深低温保存液保存效果好，但大多数学者认为，保存剂成分的复杂化和含量的提高可能对保存的组织工程产品和应用后对人体有潜在的毒害。降低玻璃化保存液中透入性抗冻剂的含量，或完全由糖类、聚合物替代以降低其毒性和解冻时对细胞的渗透性破坏是目前的主要研究方向。

表22－2　M22玻璃化保存液的组分和特性

（续　表）

a．PVA也称Supercool X－1000、PGL也称Supercool Z－1 000，均为冰形成阻滞剂；b．LM5运输溶液含90mmol／L葡萄糖（glucose）、45mmol／L甘露醇（mannitol）、45mmol／L乳糖（lactose）、5mmol／L还原型谷胱甘肽、1mmol／L盐酸腺嘌呤、28．2mmol／L KCl、7．2mmol／L K2HPO4、10mmol／L NaHCO3、1mmol／L CaCl2和2mmol／L MgCl2组成；若做冷冻保护剂的添加物，为避免沉淀形成，不加后两者；5×LM5指其成分的分子浓度增加5倍

在非渗透性保护剂中，海藻糖值得关注。很多研究认识到生物体在逆境下，都能通过体内调节合成海藻糖来抵御外界不良环境的伤害，而且少量外源海藻糖就可显著提高组织的抗胁迫能力。它的抗冻机制是多方面的：①它在冷冻之前使细胞脱水，减少细胞内的含水量，并在生物分子表面依靠带电荷的水合基团间的氢键形成保护膜，代替了维护三级结构所必需的水分子，从而使组织在极低水分时仍保持细胞膜结构功能的完整性，避免细胞内成分的损失。②使细胞脱水外，海藻糖有助于避免渗透性保护剂渗入细胞所导致的过度膨胀和渗透性休克。③海藻糖能代替脂质分子头部基团间的水分子，降低膜的相变温度，防止重新水化时脂质状态的转换及伴随出现的裂缝。④此外，海藻糖能非特异性的稳定细胞内生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子结构。目前，这种机制被认为是由于海藻糖率先包裹于蛋白质的表面，维持蛋白质的自然稳定结构。⑤另外海藻糖还显示出极佳的玻璃化特性，经海藻糖处理后，玻璃化温度接近－30℃，它比传统渗透性保护剂的玻璃化温度（＜－65℃）要明显高得多。

玻璃化保存法在保存天然皮肤上有很多报道。但组织工程皮肤产品的玻璃化溶液配方、达到玻璃化的深低温过程、损伤机制、复温条件等研究尚处于起步阶段，还需要进行深入研究，其有效性还需要实践检验。