组织工程皮肤血管化

皮肤是与外界环境接触的屏障，皮肤损伤是临床的常见病、多发病，当由于外界损伤或疾病等因素造成严重皮肤缺损时，是可能致命的。

尽管组织工程化皮肤研究取得了突破性进展，在各种器官的组织工程中起带头作用，但皮肤替代物仍存在体外培养周期过长，皮肤血管化及表皮与真皮基质相互冲突等诸多问题，使其临床应用受到一定限制。一种良好的人工皮肤替代物应具备以下特征：①较好的组织相容性；②良好的血管化能力；③为新生胶原提供理想的纤维支架。组织工程皮肤作为皮肤替代物覆盖伤口创面，能否有效促进血管形成是一个值得深入研究的重要问题。根据血管发生中内皮细胞的来源不同，组织工程皮肤血管化可分为血管生成（vasculogenesis）和血管再生（angiogenesis）。前者指血管生成来源于外源性内皮细胞及其前体细胞（即内皮祖细胞），为初级血管网的发生和形成。后者是指血管的生长来源于已存在的内皮细胞，是已存在的血管通过出芽等方式形成新的血管。在组织工程皮肤中是否加入内皮细胞目前还存在争论，一方面由于内皮细胞存在较强的抗原性，移植后会增加免疫排斥反应的可能，另一方面加入内皮细胞后是否能形成有功能的毛细血管网还有待于进一步研究确证。最理想的方法是组织工程皮肤诱导受体自身内皮细胞长入并构建具有功能的毛细血管网，尽快为组织工程皮肤的存活提供营养。

一、接种种子细胞直接血管化

利用组织工程技术构建皮肤采用的种子细胞为血管形成细胞，包括血管壁细胞和胚胎干细胞。

（一）血管壁细胞

多为血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和Fb，在体外进行培养、扩增后广泛应用于组织工程血管的研究。其来源主要有：①人体非必需的血管，如大隐静脉、脐静脉等，因脐静脉取材方便，且对人体无明显影响，目前已广泛使用；②腹膜或皮下脂肪组织，如微血管内皮细胞。Weinberg等以血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等为种子细胞，首先在体外构建出组织工程血管。也有研究者将人血管内皮细胞接种在PLLA海绵或PLG支架中，移入裸鼠体内成功分化出功能性血管并与裸鼠自身血管吻合，表达出CD31、CD34等血管内皮标记。

（二）胚胎干细胞

理论上，胚胎干细胞具有发育全能性，能诱导分化成机体中所有类型的细胞。Lenvenberg等从人的胚胎干细胞成功诱导出内皮细胞，并且在基质胶中可以形成管样结构，在小鼠体内也能形成功能性的毛细血管，为组织工程血管内皮化提供新途径。Shen等将鼠胚胎干细胞体外诱导分化成的内皮细胞注入裸鼠皮下的支架上，也成功诱导出血管样结构。但由于胚胎干细胞的免疫原性及在伦理、道德、法律等方面的制约，其应用也受到了限制。

（三）成体干细胞

根据成体干细胞的来源和分化方向可分为内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞等。其与胚胎干细胞相比，自体移植可避免免疫排斥，导致细胞“永生化”而癌变的可能性小，也不存在伦理和道德上的问题。内皮祖细胞又称血管母细胞，是成熟内皮细胞的前体。体外培养结果证实内皮祖细胞可以分化成CD34＋的成熟内皮细胞。间充质干细胞有向血管内皮细胞和平滑肌细胞分化的多向分化潜能，多位于骨髓。国内学者已在体外Matrigel上将骨髓间充质干细胞成功诱导分化成Ⅷ因子阳性的血管内皮细胞，并形成血管样结构。脂肪干细胞作为中胚层干细胞的来源，能够分化为多种细胞。Cao等证明脂肪干细胞在适当条件下可诱导分化成成熟内皮细胞，表达CD34和VE－钙黏蛋白等，在体内也能表达α－肌动蛋白，说明也具有形成血管平滑肌中层的可能。

二、细胞因子刺激血管化

多数促血管生成因子对血管生成有很强的刺激作用，一般不全身给药，多利用局部缓释系统控制各种因子释放入血促进血管生成。一般是在接种内皮细胞等种子细胞的同时，在支架内复合促血管生成因子，诱导内皮细胞等种子细胞向支架内部迁移、增殖而形成毛细血管网。常用的细胞因子有VEGF、FGF、TGF－β、PDGF等。VEGF和FGF是直接诱导内皮细胞分裂、增殖和迁移的，而TGF－β、PDGF和血管生成素等是通过促进血管周细胞和平滑肌细胞的分裂、增殖和迁移来间接促血管生成的。生长因子与支架材料共混、凝胶法将生长因子固定在凝胶网络中、微球包埋、超细纤维包埋和化学键合等是常用的控释技术。实验证明，用藻酸钙微球作为人VEGF缓释的载体，在大鼠皮下能显著促进微球内血管形成。上述其他生长因子也可明显促进组织工程皮肤血管化。

三、转基因技术促血管化

应用转基因技术将血管生成调控因子基因整合入靶细胞基因组，使其表达血管内皮细胞的某些特征，达到促血管化目的。靶细胞可以是皮肤中的KC、Fb和内皮细胞等，也可以是平滑肌细胞、内皮祖细胞等种子细胞。如将VEGF165基因转染至KC，可使其构建的组织血管化时间缩短；将VEGF或PDGF基因转染入Fb，再接种于支架上，可明显改善缺血部位的缺血情况；将血管内皮细胞生长因子基因转染血管内皮祖细胞移植，显示可促进血管新生；利用转基因端粒酶反转录酶亚单位异位表达，显著增加了平滑肌细胞的寿命，有利于血管生成。这些都显示了基因修饰通过对靶细胞基因转染促血管化的功效，但目前尚需进一步研究如何确定高效稳定的靶基因和传递系统。

四、支架材料对组织工程皮肤血管化的影响

组织工程皮肤的血管化要求在支架内形成有功能的血管网，因此支架材料要与内皮细胞等种子细胞有很好的生物相容性，有良好的生物降解性、可塑性和一定的机械强度，并有合适的孔隙率和孔隙大小，这样才能促进毛细血管长入。血管支架材料根据来源和相容性大体可分为不可降解材料和可降解材料两大类。

（一）不可降解材料

主要包括涤纶和聚四氟乙烯等，这些材料一般用于较大血管的支架，并不适合做皮肤毛细血管这样小血管的支架，而且此类材料塑形性差，无正常血管收缩性，易感染，而且支架材料不能降解也并非真正意义的组织工程理念，已逐渐被淘汰。

（二）可降解的高分子合成材料

主要包括聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）及两者的混合物聚乳酸羟基乙酸（PLGA）、聚乙醇酸（PLLA）、聚羟基丁酸（PHB）和聚氨酯（Pu）等。这些材料有良好的相容性和可塑性，可在体内完全降解，减少异物反应，但其缺乏细胞外基质中的生物信号和功能基团，与种子细胞黏附性较差。

（三）可降解的天然生物材料

包括葡聚糖、明胶、壳多糖、透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸等。此类材料本身来源于生物机体，包含许多生物信息，有良好的细胞亲和力，能够提供细胞生长、繁殖、分化所需的信号，在细胞的黏附和维持方面具有优势。其在生物相容性、顺应性和免疫排斥等方面均优于合成材料。

本实验室研制的复发壳多糖组织工程皮肤就是以鼠尾胶原（或牛胶原）、壳多糖、硫酸软骨素和葡聚糖等天然生物材料作为支架的。硫酸软骨素是存在于ECM中的一种蛋白多糖，不仅对细胞具有支持和保护作用，同时影响细胞的分化和增殖。硫酸软骨素有促进Fb增殖的作用，硫酸软骨素B通过控制多种生长因子对Fb产生作用，用软骨素酶B降解硫酸软骨素B后可以显著降低Fb的增殖，且这种抑制作用不能通过再增加硫酸软骨素B而改善。透明质酸是一种高分子量糖胺聚糖，它可以促进Fb的迁移和增生，抑制其分化，还能增强各种生长因子的活性。壳多糖是一种天然聚阳离子生物多糖，因其作为细胞外基质具有优良的生物相容性和生物可降解性，是相对于胶原更理想的生物支架。壳多糖能加强VEGF的分泌，其作用可能来源于两个方面：①通过刺激Fb增殖来增加VEGF的分泌。其机制可能有：壳多糖在体内降解生成的寡糖可以刺激各种细胞的生长，促进成纤维细胞增生；壳多糖也通过增强各种生长因子（包括PDGF在内）的表达而促进Fb增生；壳多糖可与肝素或生长因子结合，并稳定和活化这些物质，促进Fb增生；壳多糖也可能通过形成聚合电解质复合物促进Fb增生。②通过上述ECM作用促进VEGF的分泌。采用壳多糖、透明质酸、6－硫酸软骨素和鼠尾胶原（或牛胶原）等共同构成支架材料，除了更有利于种子细胞生长外，也使种子细胞在复方壳多糖支架中三维培养时能沉积大量的细胞外基质，并与这些基质相互作用，促进VEGF等促血管生成因子的分泌。

五、组织工程皮肤血管化的研究模型

组织工程皮肤血管化的研究模型可分为体外和体内两种。体外实验可以检测支架与内皮细胞的黏附、增殖和迁移、趋化作用及抑制凋亡、材料的细胞毒、血管化效应和各种生长因子的调节作用，体内最简便实用的是鸡胚尿囊膜实验，更高等的则是在完整动物体内进行。这些研究模型的检测手段涵盖了血管生成甚至血管再生。

（一）体内模型

1．鸡胚尿囊膜中刺激血管生成 将10日龄鸡胚在37℃下孵育，鸡蛋经对光检查后确定和标记一个无大血管的区域作为靶区，在蛋壳上钻孔，一个在气囊正上方，一个在靶区上方。对第一个孔进行抽吸，使尿囊绒膜（CAM）从标记区脱落。将靶区的部分蛋壳去掉，将一直径为4mm的环形样本（组织工程皮肤）放于尿囊膜附近。把孔封闭起来后，将鸡蛋置于37℃培养72h观察血管生长。然后，把已处理过的尿囊膜取出、拍照并固定在甲醇中。计数样本区域毛细血管分支点，活检的组织样本固定在甲醇中，切片采用Masson三色染色法。

与对照组比较，三维的含Fb的组织在CAM中诱导血管生成的范围应更大，具有表现出通透性增高的现象，毛细血管网也清晰可见。这种类型的毛细血管为VEGF诱导的血管生成的一种表现，它不同于用bFGF所诱导的血管，后者所生成的血管直径较大，而通透性不增高或仅轻度增高。

2．大鼠主动脉环实验 把从1～2个月大的Sprague－Dawley雄性大鼠中获取的胸主动脉转移到不含血清的MCDB131培养基或M199培养基中，小心地去除主动脉周的纤维脂肪组织，漂洗主动脉8～10次并切成1mm长的片段。在钻孔的1．5%琼脂糖凝胶中加满具有凝固血液能力的血纤维蛋白原溶液，将主动脉环放入孔中心。凝血后，加满不含血清的MCD131培养基或M199培养基，置于5%CO2、37℃条件下孵育，每天换液一次，新生成的微血管分别在第3天、第7天、第14天计数。当主动脉环与活性成纤维细胞性工程化组织共培养时，微血管生成的数量会明显增加。

（二）体外模型

1．刺激内皮细胞增殖实验 内皮细胞增殖是血管生成的关键步骤。成纤维细胞性工程化组织可通过［3 H］胸腺嘧啶掺入法来测定其刺激能力。此实验还可用来检测多种生长因子和浓缩的条件培养基对人血管内皮细胞（HUVECs）增殖的影响。HUVEC传代后用培养液重悬，细胞浓度为2．5×104个／ml。用明胶溶液等黏附因子溶液来预处理24孔板，然后每孔加入1ml细胞悬液，待细胞贴壁后，培养基改为内皮细胞无血清培养基。此培养基添加了Fb培养基或条件培养基，（条件培养基来自从单层或三维成纤维细胞培养物）。第2天时，更换为新鲜的含有1μCi／ml［3 H］胸腺嘧啶的无血清培养基。第3天时，吸干培养基，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）漂洗3遍，加入胰蛋白酶消化细胞后，将消化液和1ml PBS洗涤液吸入闪烁计数杯中，Beckman LS6500闪烁计数仪测定放射性强度。

用三维成纤维细胞培养物的培养基配制的条件培养基会刺激［3 H］胸腺嘧啶掺入到内皮细胞中，其增生效果呈剂量依赖性。

2．刺激内皮细胞的化学动力学实验可通过2种测定法来检测。第一种是化学动力学测定法，此法可测定不受任何方向限制的细胞运动，第二种是测定细胞向刺激源的迁移。这种方法是测定Cytodex－2磁珠上生长的内皮细胞从磁珠上分离下来再与培养板黏附的方法。将培养板上的细胞进行染色并计数。这些细胞与成纤维细胞性工程化组织共培养后，从Cytodex－2磁珠向培养板转移的细胞数会显著增加。

3．刺激内皮细胞化学趋化性 将聚碳酸酯膜滤纸浸泡在醋酸中过夜，用水清洗3次，时间持续1h，在0．01%小牛皮肤Ⅲ型明胶中孵育12～16h，然后空气干燥，HUVECs消化分离和重悬于培养基中，终浓度为1．0× 105个／ml。博伊登室的装配过程如下：底孔加样本或标准液每孔30μl，明胶包被的膜置于其上，然后将50μl细胞悬液加到上述孔中。博伊登室在37℃下孵育3h，然后小心将膜从博伊登室取出，把接触细胞的一面在PBS中漂洗，并用刮片刮除未迁移的细胞，膜行Wright吉姆萨染色，细胞计数，或染色强度通过对照标准曲线查出相应值，此曲线由浓度为20ng／ml、10ng／ml、5ng／ml、0ng／ml的纯化VEGF绘制出来。

由成纤维细胞性组织工程化产品的培养基配制的条件培养基可刺激细胞迁移，并呈剂量依赖性。与阳性对照组相比，三维的成纤维细胞组织培养基刺激HUVEC迁移作用更明显。

4．诱导整合素αvβ3的表达 已经证明，整合素αvβ3在血管生成过程中起着重要作用，而其对应的中和抗体能够阻断血管的形成。整合素αvβ3的表达为VEGF所诱导，而且认为它在内皮细胞迁移过程中起着关键性作用。

在FACStar上使用流式细胞计数可以测定整合素和细胞表面受体的存在。先用胰酶消化HUVECs，并将细胞重悬至浓度为106个／ml。取250～500μl细胞悬液用Hank平衡盐液（HBSS）漂洗3遍，最后重悬于含10%胎牛血清（FBS）的HBSS中，加入用10%FBS的HBSS稀释至1μg／ml的一抗，孵育30min，用HBSS漂洗3遍后，在细胞中加入用10%FBS的HBSS稀释至1μg／ml的二抗，孵育30min，再用HBSS漂洗3遍后，最后固定在200μl 10%甲醛溶液中，使其细胞浓度为106个／ml。

在正常培养条件下，培养的HUVECs表面大量表达出整合素αvβ3，然而，在以Fb为基础的组织工程化产品条件培养基使该整合素的表达显著增加。

5．血管生成生长因子的表达 生长因子的表达通过两种方式进行检测，一种是利用PCR方法测定mRNA的水平，一种是利用ELISA来测定游离蛋白的量。

利用ABI TaqMan方法通过定量反转录聚合酶链反应（定量RT－PCR）对特异mRNAs进行检测。利用一种RNA快速纯化试剂盒从细胞中提取所有RNA。然后使用引物对RNA进行反转录。利用每个反应在40～4 000 000内的5个数量级的拷贝数，对含有200ng RNA的样本cDNA的扩增情况进行实时监测，并就与质粒源性特异mRNA标准序列样本进行比较。在反转录的纯化和效率方面，将血小板源性生长因子（PDGF）B链、VEGF或TGF－β1的mRNA序列加入到RNA分离物中，然后用TaqMan方法测量其产量。对照mRNA序列是将含相应序列的质粒通过tRNA聚合酶转录得到的。以甘油醛－3－磷酸脱氢酶作为对照校正。

（周　凌）

参 考 文 献

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