组织工程皮肤免疫原性的研究现状

目前，已有多种组织工程皮肤产品成功应用于临床，如Epicel（培养的自体表皮移植物）、Dermagraft（采用有活性的异体Fb）及Apligraf（采用有活性的异体KC及Fb）等。但决定异体组织工程化皮肤移植成功和长期存活的生物学和免疫学因素非常复杂，加之文献上有很多互相矛盾的地方，导致对组织工程皮肤免疫原性的认识仍未统一。

一、移植细胞的免疫原性

目前，对表皮细胞的抗原性存在2种截然不同的观点。一种观点认为表皮细胞仍具有较强的抗原性，移植后数周甚至1周内就会被排斥。受体朗格汉斯细胞可以进入移植的培养表皮细胞中，并将异体MHC－Ⅱ类抗原或非MHC抗原呈递给受体淋巴细胞，引起特异性免疫排斥反应；另外一种观点认为在表皮细胞的培养过程，表皮细胞的抗原性发生了改变，供体的APC（朗格汉斯细胞及巨噬细胞）及白细胞减少或消失，产生免疫耐受，不能刺激受体的淋巴细胞发生免疫排斥反应，从而不引起受体的排斥反应。

不同的细胞引起宿主免疫反应的能力不同，即作为外来抗原被宿主免疫系统识别的能力不同。最大潜能介导同种异体反应的细胞被称为专职APC，这种细胞包括树突状细胞、朗格汉斯细胞、B细胞和内皮细胞等，这些细胞的共同特点之一是表面高表达MHC－Ⅱ分子。KC和Fb不是专职的APC，在正常情况下，两者均不表达MHC－Ⅱ类抗原。在体外长期培养或IFN－γ的诱导下KC、Fb可以表达MHC－Ⅱ类分子，因此有可能获得呈递抗原给T细胞的能力。但是KC和Fb缺少共刺激分子如B7－1等，且不能分泌IL－12，所以由KC、Fb呈递抗原不会导致T细胞的活化，相反导致T细胞的不敏感。

二、细胞群纯度问题

细胞群的纯度也非常关键，各个实验室细胞群纯度的差别可以导致研究结果的互相矛盾。低代的KC和Fb含有混杂细胞，其中包括专职抗原呈递细胞（如朗格汉斯细胞）、过客白细胞和内皮细胞等，还包括黑素细胞等免疫原性较强的细胞成分。朗格汉斯细胞是表皮中最重要的抗原呈递细胞，异体皮肤移植物是否被排斥与移植物内的朗格汉斯细胞密度相关，密度越高，越易被排斥。现已证明，在皮肤中刺激异源性T细胞反应并启动移植物排斥反应的主要是朗格汉斯细胞。在混合表皮细胞、淋巴细胞反应中，表皮细胞刺激有丝分裂反应的能力主要取决于朗格汉斯细胞的存在，清除供体皮肤的朗格汉斯细胞将延长异体移植物的存活时间。

移植物中的白细胞也是组织免疫原性的主要来源。这种细胞通常被称为“过客白细胞”，过客白细胞提供供者MHC－Ⅱ类抗原和共刺激分子，以激活异体反应性CD4＋T细胞。一旦被激活，CD4＋T细胞返巢到移植物，分泌各种细胞因子，后者再激活同种异体反应性CD8＋T细胞和巨噬细胞，活化的CD8＋细胞毒性T细胞和巨噬细胞再引起对异体移植物的破坏。若无过客白细胞，虽然移植物组织表达同种抗原性MHC－Ⅰ类和Ⅱ类分子，但这些实质细胞缺乏共刺激分子。与同种反应性T细胞接触，因为在缺乏信号2的情况下接受信号1的刺激，T细胞有可能被诱导成无能。

黑素细胞也是表皮中重要的细胞，现在认为黑素细胞不仅具有保护机体免受紫外线的伤害，还有一定的免疫原性。体外培养的黑素细胞表面可以表达MHC－Ⅰ／Ⅱ类分子。另外在白癜风和黑素瘤的研究中发现，黑素细胞表面和黑素瘤有特异性抗原表达。这些特异性抗原具有免疫原性，能够激活皮肤内树突状细胞，树突状细胞将抗原呈递给局部淋巴结的淋巴细胞，激活的淋巴细胞回到局部产生一系列免疫应答反应。

不同的分离方法、培养条件和传代次数都会影响细胞群的纯度。改进分离方法，如伍津津等分离表皮细胞时首先使用分离酶分离真皮和表皮，再用胰蛋白酶将表皮细胞消化为游离细胞，这种联合消化的方法，一方面有较好的表皮细胞分离效果，另一方面避免了Fb等细胞的污染。使用限制性培养基，如适合KC生长的无血清培养基如K－SFM等，能够抑制杂细胞的生长。在培养的过程中细胞不断传代，目的细胞呈优势生长状态，进一步去除杂细胞，通过以上途径能够提高培养细胞的纯度，减少杂细胞对实验结果的影响，尤其是免疫原性较强的细胞。有实验显示，表皮细胞分离培养至一定代数时，未检测到朗格汉斯细胞和黑素细胞，混合淋巴细胞反应也明显减弱，基本得到较纯的KC，因此组织工程皮肤的工作细胞应选取较高代数的细胞，降低组织工程皮肤的免疫原性。

三、三维培养条件下组织工程皮肤的免疫原性

IFN－γ是一种可以介导MHC－Ⅱ类抗原和CD40抗原表达的物质。异体组织的急性排斥反应是始于受者T细胞受体与供体细胞MHC－Ⅱ抗原结合。异体细胞的CD40与受者淋巴细胞CD154之间的相互反应能促使异体细胞CD80或CD86的出现，导致排斥反应。尽管Fb通常不表达CD80、CD86或者MHC－Ⅱ，CD40也是低水平表达，但有研究显示IFN－γ存在时诱导了FbMHC－Ⅱ类抗原和CD40的表达。真皮微环境无论在静息状态下还是炎症条件下，都存在大量的细胞因子和细胞分化信号。这些细胞因子已经被鉴定出来是真皮细胞的产物，其中包括内皮细胞、Fb和肥大细胞等。在炎症环境下，上调炎性细胞因子，其中包含IFN－γ等，可能影响到上述Fb表面抗原的表达。

分析Fb在体外单层培养和三维培养对IFN－γ的不同反应让我们看到了事物的另一个方面。来源于新生儿包皮的Fb单层培养时，IFN－γ能诱导其表达CD40和HLA－DR；而在Dermagraft中三维培养时，很少能诱导出上述抗原表达；如将Fb从Dermagraft分离出来单层培养时，又能引导出上述反应。为了评价三维培养的免疫保护效果，将Fb培养于牛胶原凝胶中，加入IFN－γ，同样观察到了与单层培养一样对CD40和HLA－DR的诱导效果。以上数据支持这样一个假说：通过将Fb种植在支架上，伴随有天然细胞外基质产生而制成的组织工程移植物，在异体移植时，比只有细胞或者将细胞种植在牛胶原中所介导的免疫反应更少。Dermagraft对IFN－γ刺激缺乏反应也得到有关在体真皮Fb对IFN－γ缺乏反应的实验支持。肌注IFN－γ能诱导KC表达HLA－DR，但不能诱导真皮Fb的反应。三维培养模式更接近细胞体内的正常环境，在这种情况下，细胞如何受到保护，减弱免疫反应，还需要进一步深入研究。

四、角质形成细胞和成纤维细胞的相互作用

研究表明，树突状细胞的表型和功能的形成与诱导微环境关系密切。GM－CSF＋IL－4体外诱导培养的树突状细胞属于成熟型，能够明显刺激异体T细胞增殖。GMCSF＋IL－4与TGF－β1联合培养的不成熟树突状细胞，其细胞表面MHC－Ⅱ类抗原呈中度或弱阳性，协同刺激分子CD80表达极弱，CD86阴性，不仅不引起宿主T细胞免疫应答，且能诱导耐受。表皮朗格汉斯细胞属于未成熟树突状细胞，这种未成熟表型与表皮中KC组成性分泌TGF－β1关系密切。TGF－β1显著影响APC刺激T细胞活化作用，明显减少T细胞分泌IL－2、IFN－γ等细胞因子，虽然不能避免异体移植物的排斥反应，但是可以明显延长移植物的存活时间。树突状细胞的抗原呈递作用可受多种因素破坏，如培养中加入低浓度GM－CSF、抗炎性细胞因子如IL－10或TGF－β1等，从而干扰树突状细胞与T细胞的相互作用。正常皮肤的表皮和真皮之间不是相互独立的，它们之间通过各自分泌的细胞因子相互联系。有实验显示，含表真皮的组织工程皮肤较单层培养KC和Fb分泌的IL－6明显增高。这与KC、Fb的IL－1／IL－6环路有关。KC分泌IL－1，Fb生成IL－6，IL－1促进Fb生成IL－6，IL－6刺激KC增殖。体内KC和Fb各自分泌多种细胞因子，并相互作用，能下调炎性细胞因子（如IFN－γ、IL－4），分泌的抗炎性细胞因子如IL－10等，是形成皮肤稳定微环境的重要因素之一。一旦皮肤内微环境被打破，朗格汉斯细胞很容易被激活，其MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ类分子表达上调，CD80、CD86、CD54、CD40等T细胞活化辅助分子的表达明显增加。此时，其摄取抗原的能力明显下降，而呈递抗原的能力显著增强。成熟树突状细胞不仅可以经MHC－Ⅱ类分子途径呈递抗原肽段给细胞毒性T细胞，而且抗原经MHC－Ⅰ类分子替代途径呈递抗原肽段给细胞毒性T细胞，分别刺激CD4＋T细胞、CD8＋T细胞增殖，产生一系列免疫反应，而且这种激活很难再被IL－10逆转。

五、支架材料

用于组织工程的支架材料可分为4大类，即合成高分子、天然高分子、无机材料及将这3类材料适当混合的复合材料。天然高分子材料（胶原、纤维蛋白、海藻酸、透明质酸、甲壳素等）的细胞相容性良好，应用比较广泛，但缺乏必要的力学特性和性能可调性，因此往往与合成高分子材料（聚交酯类、聚乙二醇、聚己内酯及它们的共聚物等）复合，以利于改进材料的综合性能，满足应用要求。

胶原是由动物细胞合成的一种生物高分子，是细胞外间质的主要成分。由不同种类的动物分离出来的胶原极其相似，不易被人体免疫系统作为异体识别，因此具有低抗原性，且有良好的生物相容性。Integra由Yannas和Burke于1980年研制的一种胶原类真皮替代品。它是由牛胶原提取物与硫酸软骨素及氨基葡聚糖交联而成的基质与其上覆盖的一层硅胶膜组成，胶原基质的纤维直径约7μm，孔径为70～200μm，这种设计能使基质与创床基底较好地整合，有利于Fb的浸润及血管化过程。硅胶膜厚约0．02cm，具有良好的通透性和屏障性。临床应用时，将Integra移植于创面上，经过2～3周，胶原基质已充分血管化，这时除去硅胶膜，在其上移植自体薄皮片。由于这种胶原基质几乎无免疫原性，因而不会诱发机体排斥反应。

壳多糖是甲壳素的脱乙酰化产品，具有无毒、无味、生物相容性好，且无抗原性等优点，其降解产物对人体无害，是目前研究的热点。壳多糖分子中有许多氨基，带正电荷，与胶原结合后，有利于上皮细胞的吸附和生长。壳多糖的纤维刚性结构有可以增强真皮基质的机械耐受力，延缓创面细菌胶原酶对真皮基质的降解。以此原理制备的壳多糖／胶原复合真皮替代物，动物实验表明移植物可以很好地覆盖创面，未出现炎症反应、排斥反应。

透明质酸一种天然多糖，包含N－乙酰葡糖胺和β－葡萄糖醛酸。广泛存在于脊椎动物结缔组织尤其是皮肤中的细胞外基质间，在体内发挥着保护组织，稳定结构和吸收冲击力的作用。由于其本身是一种天然的细胞外基质，具有生物相容性和无免疫原性等特点，使其广泛应用于临床，其中包括补充关节腔液，眼外科的手术辅料和促进手术后伤口愈合及再生。作为组织工程皮肤中细胞培养支架具有广阔的前景。

六、培养基及冻存

目前，KC所用的培养基主要分为两类，即有血清的培养基和无血清的培养基。血清的生物学效应已被证实，它含有多种生长因子和活性物质，能满足大部分细胞生长的条件。但由于动物血清成分极其复杂，对培养产物的分析、提纯及检测造成一定困难，且不明因子繁多，会影响KC生长调节机制及各项基因表达的精密调节。另外，动物血清蛋白对人体来说是异种蛋白，培养的细胞植入人体后可能引起排斥反应，因此国内外学者正在不断探索各种无血清培养基。随着细胞培养技术的发展，现在出现了一系列无血清培养基，如K－SFM、MCDB153等。这些无血清培养基具有商品化、易于购买、成分清楚等优点已被广泛应用，它的出现代表了今后培养基的发展方向。

组织工程皮肤种子细胞往往采用冻存的方法长期保存，冻存一般采用－196℃的液氮。一些学者发现经冷冻处理后改变异体组织、细胞的免疫原性，减轻或延缓移植后排斥反应的发生，从而提高移植效果。低温冷冻造成组织、细胞免疫原性下降的机制可能有：①低温冷冻破坏了移植物中残存的抗原呈递细胞，如表皮中的朗格汉斯细胞；②低温冷冻破坏了细胞表面的抗原结构；③低温冷冻造成MHC抗原丧失。通过冻存这一过程，种子细胞免疫原性进一步降低，减少了组织工程皮肤移植后免疫排斥的可能性。

七、基因工程技术的应用

自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术的核心基因工程技术得到飞速发展，基因工程技术应用于皮肤组织工程的研究，开创了新的局面。KC是表皮最主要的细胞，也是组织工程皮肤最重要的种子细胞之一。KC表面的MHC－Ⅰ分子是导致免疫识别和同种异体细胞和组织排斥的主要原因。如何下调其表面MHC－Ⅰ分子的表达成为研究的热点之一。Annette等用小鼠的KC转染抗MHC－Ⅰ内源性抗体的基因，发现强表达内源性抗体的细胞显示MHC－Ⅰ似乎被“敲除”了，同时细胞生长和其他细胞表面分子未受到影响。值得注意的是，表达内源性抗体的KC与正常KC相比，显示不易被同种异体细胞毒性T细胞攻击。这提示我们通过这种方法，可以减少同种异体组织工程皮肤移植物的免疫排斥反应。