内皮细胞在组织工程皮肤血管化上的应用

无论是在体内还是体外，组织工程产品的存活都必须供给充足的氧及营养物质。渗透作用仅能维持几个立方毫米大小组织的营养供应，所以仅靠周围组织的渗透作用，很难满足组织工程产品，尤其是较大体积工程组织的氧及其他营养物质供给。血管化是解决较大体工程组织营养物质供给的唯一方法，但血管化也是组织工程研究的一大难题。尽管组织工程皮肤较薄，血管化的矛盾不像其他大块组织工程产品那么突出，但尽早地促进移植后组织工程皮肤的血管化是决定组织工程皮肤最终能否存活的关键。

理论上，组织工程皮肤的血管化可有两种途经，一是血管吻合，二是血管诱生。

一、血管吻合

吻合是指人工组织内构建的人工血管与机体固有血管的吻合。这也是较理想的一种方式。可以想像一下，如果人工皮肤像游离皮瓣一样，已构建好毛细血管网，移植到活体后直接于受体血管网连接，成活率将大大提高。可惜有关人工皮肤目前尚无这方面的研究报道，因为这涉及人工微血管。人工微血管是一个新兴的研究课题，早期由于支架材料的限制，只能构建管径较大的血管，如PTFE、Dacron产品等，但其顺应性较差，目前人工血管的最大障碍是，现有的人工血管管径在6mm以下者尚不能维持持续的血流通过，更谈不上毛细血管水平的营养物质交换了。目前，最主要困难是血栓形成及内膜增生。目前有限的成功的尝试仅限于体外模型。因此，还有待于将来人们在微循环流体学及毫微米技术上的突破。近年来，CPU等新的聚合材料的出现，使人工微血管的构建成为可能，CPU是有较好顺应性的新生物学材料，管径可做到2mm以下，其内膜要包被防止血小板和其他细胞凝集的细胞因子，近毛细血管处要更细、更薄，孔径更大，以利于营养物质的交换。已被应用于构建人工毛细血管床，体外模型研究已取得一定成果，但其是否能在活体内成功地维持血流并供给组织营养，尚有待临床验证。

二、血管诱生

目前已有一些有关人工皮肤临床应用中血管化观察，人工真皮移植后经历渗透吸收、Fb迁移、新生血管生成，最终形成成熟的血管，然后再种植培养KC；也有人观察了人工复合皮的血管化情况，发现移植后2周近50%的病例有血管化形成。为促进移植后人工皮肤的血管化，可采取以下措施。

（一）加入促血管生长因子

促血管生长因子是最普遍地用于工程组织血管化的方法，如VEGF、bFGF。但是由于血管生长本身在体内的不稳定性及远位可能不易控制等因素，血管内注射生长因子的方法受到限制，取而代之的是采用生物可降解材料（如肝素琼脂糖）包被生长因子，可在目的地缓慢持续释放。由于血管的生成在不同时期需要不同的生长因子，有人设计了可包被2种或多种生长因子的聚合体，聚合体外围包被VEGF，在早期从聚合体周围大量的VEGF被释放出来，促使不成熟的血管形成，后期从聚合体中心释放出PDGF－BB，通过募集平滑肌细胞，促进新生血管的成熟与稳定。

（二）血管生长因子基因转染

将构建的VEGF等血管生长因子表达质粒DNA或病毒载体加载到生物材料支架上，其可较长时间地持续表达血管生长因子。体内及体外实验证明，VEGF基因转染可保护成肌细胞、人真皮微血管内皮细胞。FGF表达质粒转染表皮KC，已被用于构建组织工程皮肤，动物实验取得了可喜的结果。尚有实验发现bcl－2、端粒酶的过度表达可保护人真皮微血管内皮细胞免于凋亡，并促进移植物的血管新生。有人曾采用将多种基因转染入血管平滑肌细胞进行血管生成的调控。但基因转染存在过度表达及致癌性的风险。

（三）加入内皮细胞

尽管VEGF、FGF蛋白或基因转导来促进缺血肢体的血管侧支重建在动物实验上已获得成功，并初步被用于人体，但仅靠单一的细胞因子在人体重建功能性血管，还不太理想。人脐静脉内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、牛毛细血管内皮细胞已被用于体外模型的血管化研究。胶原、纤维粘连蛋白、明胶等用作基质来建立二维或三维培养。将人真皮微血管内皮细胞种植到生物可降解聚合材料上，再植入免疫缺陷小鼠内，1d后开始迁移，5d可形成毛细血管样结构，1周形成成熟的微血管，21d与机体血管系统发生吻合。人脐静脉内皮细胞在无血清培养中培养，也可发生类似于人胚胎期血管发生阶段的毛细血管样结构形成及血管襻的形成。胚胎干细胞、人肺微血管内皮细胞，在胶原等基质上培养，可形成毛细血管样的管状结构，并可加入不同浓度梯度的生长因子、进行基因转染或改变基质的生物力学张力等进行调控。在无血管生长因子存在时，移植到体内后内皮细胞很快出现凋亡。为维持内皮细胞存活，可结合基因转染技术。但人血管内皮细胞作为种子细胞用于组织工程皮肤血管化的实验研究已成功，如要最终用于大量生产的组织工程皮肤，则细胞的来源将成为主要问题。血管内皮细胞不同于Fb，其不同个体、同一个体不同组织的异质性较显著，如用于组织皮肤最好采用皮肤微血管内皮细胞，而且其在体外的增殖能力也有限。此外，由于内皮细胞有较强的免疫原性，容易产生排斥反应，移植后难以真正形成血管网，从而导致移植失败。

（四）加入内皮祖细胞

成熟的内皮细胞由于扩增能力与活力不足，使之在组织工程组织的血管化研究中受到限制。近年研究认为血液循环中存在一种内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC），它可分化为成熟的内皮细胞，并参与组织血管化。局部缺血、VEGF及GM－CSF可刺激循环中的EPC增加。将EPC注射到实验动物的缺血肢体，可改善局部的血流。该实验进一步说明了EPC的分化及募集在组织血管化中的重要作用，为临床试验中血管化的治疗提供了一种新手段。最近，EPC及Flk－1＋的胚胎干细胞被用于组织工程替代物的构建。Flk－1＋的胚胎干细胞在PDGF－BB或VEGF的存在下，可分别分化为血管平滑肌细胞和内皮细胞。EPC主要来源于骨髓及血管壁，可从血循环中收集或体外人工培养。但由于EPC缺乏特异性表面标记及缺少定义该独特细胞群的功能分析方法，所以，目前对EPC的认定尚无统一的标准。EPC与成熟内皮细胞、造血干细胞许多表面抗原表达是共同的，如EPC与成熟内皮细胞皆表达VEGFR－2、Tie－1、Tie－2、VE－cadherin；有些表面抗原又与造血干细胞有共同表达，如CD34、vWF等，这就使EPC的分选更加困难。但目前比较认可的是，以CD34、VEGFR－2、AC133作为相对特异的标记组合来筛选EPC。

（五）预血管化

所谓的“预血管化”，是先制作由生物聚合物构建的血管网络样结构，再种植细胞成分，组织工程替代物围绕血管网样结构构建。若要加强内皮细胞的黏附，可在支架上吸附黏附分子。该技术已被应用于人工肝的研究中。

多年的实践证明，组织工程替代物要达到理想的血管化，应遵循以下指南：①组织工程的基质（细胞支架）必须具备高度的生物相容性，以利于内皮细胞的生长及毛细血管的形成，基质也可包裹胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等支持毛细血管黏附生长的物质，基质还应高孔隙率和互穿孔性，允许新生血管的在组织工程替代物内穿入。②在组织工程替代物内加入缓慢释放的血管生长因子，或从遗传学上改变植入的细胞，使之自身能分泌血管生长因子，并诱导循环中的内皮祖细胞迁移至移植部位以促进组织血管化。③组织工程替代物内加入内皮细胞或内皮祖细胞，可在组织工程替代物中先利用内皮细胞构建成毛细血管，移植后与机体的血管网发生吻合，若掺入内皮细胞且能自分泌血管生长因子，则可能更有利。④工程组织内的血管生长应能控制，以获得正常的血管网。如长时间过度产生VEGF，可能形成畸形无功能的血管。血管生长因子的释放量及时相须能控制，早期需要大量的VEGF，以利于内皮细胞的募集、增生、分化，形成内皮管样结构；然后有TGF－β分泌，以募集外皮细胞及平滑肌细胞；再后血管的成熟及稳定需要血管生成素及PDGF；最后为防止血管的过度产生，需要抗血管生长因子，如内皮抑素。