朗格汉斯细胞的基本研究方法

一、朗格汉斯细胞的分离和培养

目前，培养朗格汉斯细胞主要有骨髓、外周血和脐带血3个途径。其中，外周血取材简单方便，是目前获得树突状细胞采用较多的方式。许多实验室尝试采用在体外诱导树突状细胞前体细胞CD34＋细胞分化的方法获得树突状细胞，这些方法均需先分离、纯化CD34＋造血干细胞，操作复杂、费用昂贵，而且所获树突状细胞的数量和纯度有时仍不能满足临床应用的要求。

（一）从血液中分离和诱导朗格汉斯细胞前体细胞

目前，有多种方法从血液中分离朗格汉斯细胞的前体细胞。

1．脐带血CD34＋细胞 正常分娩婴儿脐带血中富含CD34＋造血前体细胞，可使用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心去除粒细胞和红细胞，用粘贴分离的方法去除单核细胞，再通过免疫磁珠进行阳性选择的方法分离出CD34＋前体细胞。

2．外周血CD14＋单核细胞 将外周血经密度梯度离心后得到单个核细胞，再通过免疫磁珠分选出CD14＋细胞。

3．单核细胞 外周血经梯度离心去除白细胞后，将得到的细胞采用粘贴法去除悬浮细胞后，剩下贴壁的单核细胞。

培养朗格汉斯细胞广泛采用的是多种细胞因子联合诱导树突状细胞前体细胞的方法。GM－CSF是维持树突状细胞发育和分化最根本的细胞因子，但是人外周血单核细胞单独加入GM－CSF只能产生少量的树突状细胞集落，更多是生成巨噬细胞；IL－4可抑制单核细胞向巨噬细胞、粒细胞的转化，GM－CSF联合IL－4可诱导产生大量表型和功能均典型的树突状细胞。但这种树突状细胞并非朗格汉斯细胞。增加TGF－β1使单核细胞向朗格汉斯细胞分化，TGF－β1明显改变了树突状细胞的成熟，表现在：①TGF－β1诱导了细胞不成熟的表型：绝大多数细胞内表达MHC－Ⅱ抗原分子，低表达CD80抗原，不表达CD83和CD86抗原，丧失TNFRIp55分子的表达。②在抗原等刺激下不表达IL－10。③TGF－β1抑制细胞在非特异信号（如细菌脂多糖、TNF－α和IL－1）刺激下的成熟，但不能抑制朗格汉斯细胞在同源CD40L的刺激下的成熟。④TGF－β1对于诱导伯贝克颗粒的形成也是必需的。诱导朗格汉斯细胞前体细胞的实验方案众多，采用细胞因子的搭配不同，剂量也各不相同。诱导出的朗格汉斯细胞部分具有体内正常情况下朗格汉斯细胞的特征，但与之仍有一定的区别。

朗格汉斯细胞的培养中是否需要血清仍存在分歧。多数实验在培养过程中使用了10%左右的胎牛血清，Barbaroux等更是认为培养朗格汉斯细胞的过程中胎牛血清是必需的，但也有实验声称采用无血清培养条件下培养朗格汉斯细胞获得了成功。血清中含有复杂的抗原成分，容易刺激朗格汉斯细胞的成熟。由于不同成熟状态的细胞同时存在，所以获得的细胞多为异质性的，不利于研究树突状细胞的分化、发育及相关信号转导。在无血清环境下，可把树突状细胞的成熟分为多步，有利于研究不同细胞因子对树突状细胞分化、发育的影响。

（二）从皮肤组织分离朗格汉斯细胞

将皮肤组织消毒后剪成皮片，4℃下用0．5%分离酶孵育16h后，分离真表皮，将表皮置于0．25%胰蛋白酶中，37℃消化30min，200目尼龙网过滤，再经淋巴细胞分离液梯度离心后，中间一层云雾状细胞含大量朗格汉斯细胞。进一步采用免疫磁珠的方法，使用CD1a单抗，经流式细胞仪检测分选后获得CD1a＋细胞。这种方法明显提高朗格汉斯细胞的纯化率。另外，可以类似组织块法培养朗格汉斯细胞，朗格汉斯细胞可以培养的人体皮肤中游离到培养基中而分离得到。但朗格汉斯细胞在体外培养时一旦离开皮肤，其免疫表型更接近成熟的树突状细胞，因此这种方法已很少使用。

二、将朗格汉斯细胞重新构建入皮肤

KC和朗格汉斯细胞均是表皮中重要的细胞，2种细胞相互作用，在皮肤免疫防御系统中起重要作用。体外构建含有多种细胞的模型对于研究皮肤中细胞间相互作用，进一步模拟真正意义上的“皮肤”具有重要意义。Magali等为研究上皮细胞在特异性免疫反应早期作用时，将培养的阴道上皮细胞种植在Matrigel凝胶饲养层上行复层培养，然后将荧光染料标记的朗格汉斯细胞加入多层上皮细胞表面，激光共聚焦显微镜下观察朗格汉斯细胞与上皮细胞整合的情况，结果显示朗格汉斯细胞与上皮细胞迅速整合，在趋化因子CCL20的作用下通过上皮细胞。该模型对于研究病原体如何通过表皮，尤其是HIV感染的机制提供了一个有力的工具。

Schaerli等使用从人外毛根鞘来源的表皮干细胞体外构建人表皮替代物。该替代物表达皮肤典型的分化标志，在组织学上与正常皮肤相似，包括基底一层立方形KC，4～8层逐渐分化的扁平KC，3～5层细胞的颗粒层和角质层。将荧光染料标记的CD14＋树突状细胞前体细胞接种至表皮替代物表面，7d后所有荧光标记的细胞均进入表皮替代物基底细胞上层。荧光记数显示约1／3的细胞存活，而没有与KC共培养的CD14＋树突状细胞前体细胞迅速死亡，提示了表皮替代物能够提供朗格汉斯细胞前体细胞存活的信号。CD14＋树突状细胞前体细胞在表皮替代物中能够分化，多数细胞获得CD45阳性标记，部分高表达HLA－DR，并丧失单核细胞标记CD14的表达，较多细胞表达CD1a、Langerin、IgE高亲和力受体、CD40和CD205等，并表现出树突状细胞样形态，表明CD14＋树突状细胞前体细胞在分化过程中逐渐获得了朗格汉斯细胞的部分特征。值得一提的是，CD14＋树突状细胞前体细胞与浸没培养的单层KC共培养时，无法检测到上述分化特征，表明连续分化的表皮对于树突状细胞前体细胞向朗格汉斯细胞的发育是必需的。由于朗格汉斯细胞不易在体外传代和增殖，所以将其整合到重建的人皮肤替代物中仍是一个难题。

（毕建军）

参 考 文 献

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