黑素细胞的基本研究方法

一、细胞染色

（一）L－多巴染色

爬片的黑素细胞先固定漂洗，石蜡切片先脱蜡至水，加入新鲜配置的0．1%L－多巴／磷酸缓冲溶液，37℃，5%CO2孵育，大约4h后漂洗，倒置显微镜下观察，阳性者呈灰色至黑色，黑素不改变颜色，胶原纤维无色或呈浅灰色。

（二）银氨染色法或称为Fontana染色

黑素颗粒嗜银，用硝酸银氨孵育可以显示出黑素颗粒分布于KC内和黑素细胞树突内，从而衬托出下部的黑素细胞。

（三）S－100蛋白染色

细胞爬片，磷酸缓冲溶液（0．01mol／L，pH7．4）洗2次，丙酮固定8min后，磷酸缓冲溶液浸洗5min。用小鼠抗人S－100蛋白单抗为一抗，ABC法进行免疫组织化学染色。根据其位于基底层一般可判断其系黑素细胞，但有时朗格汉斯细胞也可存在于基底层，而且我们在应用中还发现，不少皮内痣未累及表皮的黑素细胞，在做S－100蛋白染色时，表皮基底层未能显示阳性的黑素细胞。

（四）其他标记

目前，对幼稚的黑素细胞或者黑素母细胞仍未发现某种特异的分子标记，Cook推荐使用S－100、HMB－45、MART－1、TYR－5C12、TYR－5C13、TYP1－B8G3等多种抗体结合来鉴定。识别前黑素小体抗原也是一种较可靠的方法。目前常用NK1／β、抗TRP－1抗体、TA99、Mel－5等抗体综合判断。

二、电 镜

黑素细胞胞浆电子密度低，以5 000倍以上的条件观察还可发现黑素小体（melanosome），主要位于细胞上部的周边。黑素细胞胞核常不规则，胞浆内无张力细丝，有发达的粗面内质网、线粒体及高尔基复合体。

三、功能检测

（一）黑素含量测定

将待测黑素细胞消化制成单细胞悬液，离心后弃上清，加入1ml 1mol／L的NaOH（含10%二甲亚砜），置80℃水浴中1h或者振荡5min。取200μl于96孔板，在酶联免疫检测仪上测490nm波长吸收值。同时用合成黑素制作标准曲线。

（二）酪氨酸酶活性测定

以L－多巴为底物，参考Maeda等的方法测定细胞酪氨酸酶活性。将待检细胞洗涤2次，每孔加90μl 1%的Triton X－100，振荡5min以溶解细胞，每孔加10μl 10mg／ml的L－多巴，37℃孵育30min，在酶联免疫检测仪上测490nm波长吸收值。

四、皮肤黑素细胞纯培养

见第三篇中相关内容。

五、含黑素细胞的表皮重建

皮肤色素形成过程复杂，仅有纯培养的黑素细胞还不足反映体内复杂的细胞间调节，还要考虑邻近KC、Fb、细胞基质等发挥的重要作用。近年来在实验室构建出了含有黑素细胞的表皮或者全层皮肤替代物，并发现这类替代物能为研究色素形成和光防护提供了一个新的工具。2003年我国首次构建了含黑素细胞的组织工程全层皮肤。利用胶原凝胶复合共培养的KC和黑素细胞，通过调节细胞密度，制备出了不同深浅颜色的表皮替代物，观察到该表皮替代物具有三维结构，接受UVA照射后能发生色素沉着。

（卢　涛　高天文）

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