皮肤组织工程学的基本原理

一、设计原理

每种组织都经历不断的重建。分离的细胞在适宜的三维支架、激素、生长因子等组织诱导物质支持的条件下能重组成原来的组织结构，它们可用于体内和体外的基础研究或皮肤移植。设计组织工程皮肤必须考虑患者的安全性、有效性和使用的便捷性。

皮肤组织工程学的基本技术原理是将体外扩增培养的皮肤种子细胞（主要是Fb和KC）与天然细胞外基质、复合或合成的可降解生物相容性材料相结合，形成细胞－材料复合物，在体外培养一定时间后植入动物或人体内，用以修复皮肤缺损。种子细胞继续增殖或被接受移植者的细胞替代、血管长入，材料逐渐降解、吸收，形成在形态和功能方面与正常皮肤组织相一致的新皮肤，最终达到修复皮肤创面、恢复皮肤功能的目的。如图1－1所示。皮肤组织工程学的方法分为两类，一类是细胞种入水凝胶或多孔材料用于皮肤组织替代，一类是材料诱导皮肤组织再生。目前，前一种方法在皮肤组织工程学中应用广泛，占主导地位。后一种方法只在少数产品中体现，如Integra、Dermagraft、Pelanac。

图1－1　组织工程皮肤形成原理及其应用

二、基本研究内容

皮肤组织工程学研究的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，因而种子细胞、支架材料和组织构建是最基本的三要素。研究组织工程的目的是造福患者，所以还涉及临床应用的问题。同时，含活细胞的产品还涉及皮肤保存的技术问题。当组织工程皮肤只被用来做细胞间相互作用、化妆品及药物毒理等基础研究使用时，满足上述3个基本要素就足够了。要做产品，则必须同时解决上述5个方面的问题。

（一）种子细胞

种子细胞是组织工程体外重建皮肤的物质基础之一。移植成活后，由于接受移植者的细胞和血管长入，原始种子细胞的存亡及作用还存在争议。种子细胞的来源有3条途径，即自体、异体和异种。虽然应该首选自体细胞，但来源有限且扩增需要时间，不能随时使用，还存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化等问题。后两者虽来源广泛，但存在免疫排斥、传播病毒等潜在风险，不是理想的选择。理想的皮肤种子细胞应该满足：①来源方便；②增殖能力强，生命周期长，便于建系；③生物学功能与在体皮肤细胞一致；④纯度高，不含黑素细胞、朗格汉斯细胞等其他杂细胞；⑤无免疫排斥。

由于皮肤Fb相对容易分离和扩增培养，因而容易获得足够的使用数量，大多数皮肤种子细胞的研究主要集中在KC的培养及扩增技术上。但常规方法分离的KC多属于已分化细胞，其研究重点集中在扩增技术、延缓老化、防止分化等方面，但突破有限。目前，皮肤种子细胞的研究前沿是干细胞，包括胚胎干细胞和成体多潜能干细胞，扩增技术、延缓老化和定向诱导向皮肤分化是其核心内容。

1．大规模培养 微载体、生物反应器等技术用于细胞的快速大量扩增。

2．延长细胞的生命期 采用自身转化、化学、物理、病毒等方法诱导细胞转化，使其永生化或生命期延长；采用各种生长因子和端粒酶，调节与延缓细胞的老化。改变培养条件也是研究的方向之一，如在缺氧条件下培养KC，可以显著增加倍增率、延长生命周期，并保持克隆形成能力；人羊膜上皮细胞条件培养基可促进KC生长，两者共培养可促进KC形成分层分化的膜，说明特殊的生长因子可影响KC的生长、分化。

3．提高成纤维细胞分泌细胞外基质的能力 在细胞与支架材料的相互作用过程中，种子细胞与材料的黏附是基础，细胞必须与材料发生适当的黏附才能进行迁移、增殖和分化。细胞对材料表面的黏附性不仅影响组织工程皮肤的形态保持，还影响细胞间信息传送和功能调节。因此，如何增加合成材料的黏附性是组织工程支架不可避免的问题。一些细胞因子对皮肤Fb的功能有着重要影响，如碱性成纤维细胞（basic fibroblast growth factor，bFGF）可促进Fb的增殖，维生素C可促进Fb分泌细胞外基质。

4．异体移植的免疫学 由于自体细胞的不及时性，异体细胞仍然是目前组织工程皮肤的主要选择，因此，异体细胞来源的组织工程皮肤，其移植免疫学值得深入研究。Apligraf在这方面的工作做得很好。诱导皮肤原发性免疫应答的最初阶段是树突状细胞（朗格汉斯细胞和真皮的树突状细胞），即抗原提呈的过程，它们摄取抗原并迁移出皮肤至引流淋巴结，并激活T细胞。KC、Fb与T细胞之间的相互作用对于皮肤组织工程学使用同种异体细胞具有重要意义。在正常情况下，KC和Fb不表达主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ类抗原；然而，它们在γ－干扰素的诱导下可以表达MHC－Ⅱ类分子，因此获得了将抗原递呈给T细胞的能力。由于KC和Fb缺少必需的共刺激分子，所以由KC、Fb进行的抗原递呈不会导致T细胞的活化，而是导致T细胞的不敏感或T细胞的失活。而且，皮肤排斥反应的模式很可能是通过攻击正常皮肤移植物中的血管来完成的。此外，自体细胞皮肤移植物可以避免免疫原性的产生，但是自体细胞移植物有明显的局限性。活检下来的移植物需生长几个星期，并且在供区又制造了另一个伤口。有些患者（如严重烧伤的患者）可能没有合适的供皮区。利用自体细胞重复制作复合人类皮肤替代物在技术上存在一定困难，费时且费用昂贵。因此，我们可以有效地使用人异体细胞来构建组织工程皮肤替代物。Apligraf在临床应用时也未发现排斥反应。

5．干细胞工程技术 如何得到既能在体外大量增殖，又能定向诱导分化为包括皮肤在内的特定组织类型的细胞是组织工程面临的一个重要课题。干细胞成为组织工程新种子细胞来源的希望。干细胞工程就是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对胚胎干细胞、各种间充质干细胞进行体外分离纯化、定向诱导分化、转基因及体细胞核转移等，进而大量扩增，并与支架材料整合构建，在体外重构人体骨、软骨、肌肉、肌腱、瓣膜、神经、血管、皮肤、角膜等组织。将体外大量扩增的具有多向分化潜能的干细胞，接种在能提供向皮肤定向诱导分化微环境的支架材料中，就可达到再生皮肤的目的。也就是说，只需要接种一种细胞就可同时获得表皮、皮肤附属器和真皮。虽然最近美日科学家通过转基因技术获得了具有这种功能的干细胞，但要想真正在医学临床上应用尚需时日。其中，人成体干细胞是这一领域的研究热点。

（1）胚胎干细胞：胚胎干细胞能够分化为机体的各种细胞和组织。目前，许多能够在体外无限增殖并保持一个正常的整倍体核型且具备多潜能的人类胚胎干细胞系已经建立。研究主要集中在胚胎干细胞的自我更新调控机制、皮肤细胞定向分化机制等方面。另外，胚胎干细胞还存在移植免疫排斥、伦理学、取材困难和移植安全性等问题。

（2）诱导式多能干细胞：美国威斯康星大学麦迪逊分校及日本京都大学的科学家分别在《Cell》和《Science》期刊上报告，皮肤Fb通过利用病毒导入基因的“基因直接重组”技术，成功转化成为诱导式多能干细胞，这种细胞能够在体外无限增殖并保持正常的整倍体核型，且具备多潜能的分化功能。

（3）成体干细胞：其中表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞是皮肤组织工程学研究的热点。

①成体表皮干细胞：表皮基底层、毛囊区和胚芽毛囊基质中有表皮干细胞，其中1%～10%的基底细胞为干细胞。在手掌、脚掌等无毛皮肤中，干细胞与短暂扩增细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层，呈片状分布；在有毛皮肤中，毛囊间表皮内无干细胞，其更新所需的干细胞来源于毛囊的隆突部。毛囊是多功能表皮干细胞的主要富集处。表皮干细胞的表面标志物有β1－整合素、角蛋白19、角蛋白15、细胞表面角蛋白10G7、α6－整合素、CD71、p63、CD34、CD29、钙粘连蛋白等。但不能将表皮干细胞与短暂增殖细胞分开，而且，毛囊表皮干细胞离开龛位后，分化被激活，目前的技术水平不易获得毛囊表皮干细胞。由于毛囊与创面修复密切相关，因而毛囊上皮干细胞在皮肤组织工程学中的作用逐渐受到重视。

②骨髓间充质干细胞：骨髓干细胞的来源充足，易于获得。其增殖能力强，体外能大量扩增，能满足组织工程需要大量细胞的要求。患者可用自体骨髓细胞移植，完全克服异体种子细胞的免疫排斥问题。骨髓间充质干细胞在一定条件下可以分化为不同间充质组织，包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质，为组织工程提供了种子细胞来源。有研究表明，骨髓间充质干细胞在皮肤创面微环境下可分化为表皮细胞和血管内皮细胞，所构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。但在组织工程皮肤的应用上尚处于起步阶段，仍有许多问题有待解决，如体外扩增后如何长时间保持多能干细胞的生物学特性，如何调控其定向分化成表皮细胞等。

③脂肪间充质干细胞：在合适的体外培养条件诱导下，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞、平滑肌细胞。但目前其性质并不是很清楚，可能是一种混合的祖细胞群。脂肪间充质干细胞来源广，取材方便，对供体损伤小，已经在骨、软骨、脂肪组织工程中有较多研究应用。最近的研究表明，脂肪间充质干细胞可以被全反式维A酸诱导分化为表皮细胞；在维生素C刺激下，可以合成大量细胞外基质并维持向成熟脂肪细胞的分化。脂肪间充质干细胞可能成为组织工程皮肤种子细胞的一种选择。有学者报道，用脂肪间充质干细胞与表皮干细胞构建的双层皮肤替代物，比用Fb与表皮干细胞构建的皮肤替代物更能获得较好的表皮分化，并能更好地维持表皮干细胞的增生潜能。

目前，对干细胞的了解还不足以指导组织工程实践。干细胞研究多停滞在分离纯化、扩增培养和定向诱导分化的研究阶段。对于控制干细胞精确增生和分化的机制，理论环境和外部环境对干细胞表型、活性和分化的影响，信号随机波动的反应，影响调节分化过程的细胞因子、生长因子、形态发生素和黏附分子的转录反馈，再植入后功能维持情况等，还需要进一步研究。寻找最合适的皮肤干细胞来源、操作性强的稳定多向分化诱导方案、建立免疫豁免皮肤干细胞库等是新的研究方向。

（二）支架材料

支架材料主要用于模拟正常皮肤组织细胞外基质的生物学功能，为新皮肤的形成提供三维空间，为皮肤再生提供微环境。支架对细胞的行为和组织发育起着重要作用，它是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构建皮肤组织的形态和功能。在组织工程皮肤（细胞－支架复合体）植入皮肤缺损部位后，支架逐渐降解、吸收，而移植细胞继续生长，分泌细胞外基质和生长因子，形成与正常皮肤相似的新生皮肤，促进创面愈合。因而，支架材料的生物相容性、可降解性与可吸收性对重建皮肤的质量有着重要影响。理想的支架材料应具有以下特点：①生物相容性好，无毒，在体内不引起炎症反应和免疫反应；②表面相容性好，适于细胞黏附和生长；③可降解性好，能被自身组织取代；④力学可塑性好，既能重建皮肤的三维结构，移植后在体内一定时间内又能维持需要的形状；⑤结构相容、黏附性好，利于血管长入；⑥容易保存、消毒。目前，应用于充当皮肤细胞外基质的生物材料包括天然细胞外基质、合成材料和复合构造的新型生物材料。

1．天然细胞外基质 包括单一提取的细胞外基质成分和完整的无细胞真皮基质。前者如胶原、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白、壳多糖、藻酸盐、天然珊瑚及其衍生物等，可单独使用，也可以两种或两种以上联合使用。其中，胶原是体内分布最广的结构蛋白，通过调节移植物中胶原的浓度及其分子间的交联程度可以控制其体内的降解率。胶原蛋白还具有一些细胞黏附区域，可与细胞之间相互识别与作用，能够保持多种细胞的表型与生物学活性。目前研制的大多数组织工程皮肤产品均含有胶原成分。藻酸盐是一种海草提取物，具有很好的生物相容性，韩国有此类皮肤产品的报道。壳多糖是β－1，4键重复链接含N－乙酰基的氨基葡萄糖单位的聚阳离子多糖，类似哺乳动物GAGs结构。它具有天然、安全、无毒的特点，可生物降解成正常机体成分的良好生物相容性，还具有止血、抑制细菌和真菌生长、促进KC增殖的生物学特性，但超过一定浓度将抑制Fb的生长，被广泛用于骨、软骨、皮肤、神经等组织工程支架材料。无（脱）细胞真皮基质是通过一系列机械／化学方法去除同种或异种皮肤组织、动物小肠黏膜下组织、胎盘等组织中的所有细胞成分而获得富含胶原和基底膜成分的细胞外基质。完整的天然细胞外基质内存在着某些生长因子，可诱导调节细胞的生长、增殖、分化等，可为皮肤缺损的修复提供移植后真皮结缔组织长入的最佳三维空间和表皮原位爬行生长的支架。国内外均有应用。

天然细胞外基质的优点是无毒，亲水性、生物相容性及细胞亲和性好，可促进种子细胞的生长和扩增。但多存在力学性能差、降解速度快、加工性能差或价格昂贵等缺陷，因而难以直接作为细胞支架使用。可通过物理、化学交联等加工处理改善上述缺陷。另外，天然细胞外基质的质量受产地、来源等影响，不同来源的同一天然材料，其孔径、降解速率、力学强度等差别较大，重复性差，难以形成标准化产品。

2．合成材料 主要指合成聚酯，包括聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、两者的共聚物（PGA－PLA）、聚乳酸－己内酯的共聚物（PLC）、聚原酸酯、聚磷苯酯、聚酸酐等。经实验验证，它们具有较好的组织相容性，可在体外对其强度、结构及降解速度进行精细调控，使之满足移植的应用要求。这些物质分子间的酯键通过非酶水解的方式降解，其降解产物最终以H2O和CO2的形式排出，通过改变聚合单体的分子量及各种单体的比例，能够在几周至几年的范围内调节其降解速度。可借助电脑辅助设计制成预设的形状与超微结构。在已报道的组织工程皮肤中多单独使用。其优点在于机械耐受性好，易于操作处理。但存在黏附性差、表面疏水性和丢失接种细胞的问题，移植后易引起宿主的异物排斥反应等。即使在材料表面固化黏附肽，仍难以模拟细胞期待的细胞外基质环境。合成可降解水凝胶可以方便地携带细胞和（或）活性分子到需要修复的部位，因此逐渐受到青睐，有人将这一相关研究称为智能基质技术（smart matrix technology）。

3．天然材料与合成高分子材料复合构造的新型生物材料 该材料可以较好地解决上述两种材料的缺点，实现优势互补，是支架材料研究的热点。组织工程中支架材料的生物活性取决于支架材料的组分。支架材料科学的组合，合适的成分对种子细胞的黏附、生长、分化及自身的活性等都极为关键。两者的结合，既改善了材料的力学性能，又解决了细胞黏附性的问题。如PGA－胶原海绵支架（将胶原海绵支架嵌在PGA孔中）比单纯的胶原海绵支架更有利于细胞的黏附和生长。猪Ⅱ型胶原修饰的PLLA和PLGA支架材料比单一的合成材料更能减少炎症反应的发生，有助于细胞的黏附、扩增及细胞外基质的分泌。

细胞与生物材料相互作用的研究，研制出利于细胞迁移、黏附、增殖、定向分化及特定组织形成的复合型生物活性智能材料；生物材料与组织构建技术相结合研究，以解决中心部位营养不良的问题，构建适合不同组织器官的具有不同三维空间构象及有序排列的不对称型复合材料等内容是目前支架材料的研究方向。

（三）组织构建

根据构建组织培育环境的不同，组织构建技术分为体外构建和体内构建。体外构建是种子细胞和支架材料在体外形成较成熟的组织后再用于组织修复。优点是便于观察组织的形成情况，相关影响因素易于分析和控制，但不能完全模拟体内生长环境，培养条件要求较高，一般用于培养条件要求简单的软骨、表皮、肌腱等。体内构建组织则将种子细胞和支架材料直接或在体外短时间培养后再植入体内，其优点是体外培养周期短，不需要特定的培养装置和环境，完全依赖体内环境促进组织再生和成熟，适于组织结构比较复杂的血管、神经、肌肉、骨等，但组织形成过程不易观察，受个体差异及植入局部微环境的影响，组织再生结果差异较大，构建结果的稳定性和重复性较差。组织工程皮肤的组织构建多使用体外构建技术，少有使用体内构建技术的报道。

1．构建组织工程皮肤的技术方法 一般分为以下5种方法。

（1）单一的支架材料：如Integra、Pelanac、Alloderm等不含细胞的真皮替代物。修复真皮等容易再生的组织时，由于Fb较强的增殖活性，可从创面长入支架内，因此种子细胞可能不是必需的。

（2）支架材料与活细胞：包括仅在支架材料中接种Fb，如Dermagraft，以及同时在支架材料上接种Fb和KC，如Apligraf。

（3）支架材料与生长因子／基因：包括在支架材料内接种Fb，待其分泌足够的细胞外基质和细胞因子后用不同方法处死细胞，如Dermagraft－TC，以及在支架材料内通过DDS技术携带缓释特定的生长因子和基因。

（4）单一的细胞膜片及有支撑物的细胞膜片：如Epicel、EpiDex。

（5）细胞、细胞支架及DDS技术的结合：在接种活细胞的支架上携带生物活性信号分子的明胶微球，是一种新兴的皮肤组织工程技术。

2．构建组织工程皮肤的工艺流程 建立组织工程皮肤标准化生产流程是保证不同批次组织工程皮肤产品大小、厚度恒定的关键，是保证产品质量的必需步骤。已商品化的Dermagraft、Apligraf等组织工程皮肤产品均建立了相应的标准化生产流程。Dermagraft建立了真皮替代物的生产流程，它是在一个具有许多独立单元的封闭生物反应器内制造的，产品成熟后，将这些独立单元直接封入包装袋保存、出售。Apligraf建立了双层活皮肤替代物的生产流程，它是在一个精心设计的培养装置中制造的，产品成熟后，将该装置完整封入包装袋保存、出售。它们的共同特点是从生产到使用前没有因机械外力搬动组织工程皮肤造成的人为破坏，从而保证了产品结构和外观的完美性。同时，由于避免了直接搬动皮肤产品的中间步骤，也减少了污染的机会。

由于皮肤的组织组成、结构和功能的复杂性，目前技术只能实现皮肤功能的部分替代。因此，皮肤发育的微环境和生物力学对皮肤发育的影响、细胞和细胞及细胞和支架之间的相互作用仍需要深入研究。

（四）组织工程皮肤保存技术

不含活细胞的皮肤替代物产品保存很容易，但含活细胞的组织工程皮肤产品尤其是双层活皮肤替代物的保存有很大的难度。Dermagraft用含10%二甲亚砜、10%胎牛血清的保存液，－75℃保存，可保存半年；Apligraf用基于琼脂糖的固体营养培养基的常温保存法（20～23℃），只能保存5～10d；OrCel采用与Dermagraft类似的深低温方法保存，保存期为半年。但大多数学者认为，采用冻存的低温保存技术保存的组织工程皮肤组织活力较差，只有约30%的活力。玻璃化保存可能是组织工程产品更理想的保存方法，已报道成功保存了关节软骨、新生儿皮肤、心肌、肾脏及组织工程血管、组织工程肝和组织工程胰腺。

双层组织工程皮肤中含有大量活细胞，它们在创面修复过程中起着重要作用，如何有效保持其长时间的活力有待于进一步研究。另外，其保存技术还要考虑运输条件。对深低温保存技术而言，液氮保存将导致运输困难，而维持运输时深低温环境的最经济手段是利用干冰，因而能保持皮肤最大活力的深低温温度最好控制在－60～－80℃。因此，研究能在－60～－80℃较长时间维持双层组织工程皮肤活力的玻璃化保存技术是完整组织工程皮肤技术的必需环节。

（五）组织工程皮肤的临床应用技术及规范操作

组织工程皮肤是一个新生事物，在临床上的应用时间还很短，积累的临床病例数量也不多。从Apligraf的短暂应用实践来看，由于各种原因，可能发生创面感染、蜂窝织炎、骨髓炎等其他严重感染，甚至威胁患者生命。因此，其安全性应该严格把握。建立包括生产过程和使用前的完整生物安全性检测、运输规范、全面的产品说明书、规范的临床使用步骤、发生异常情况的处理流程等是保证组织工程产品，尤其是含活细胞的双层组织工程皮肤产品安全性的必要前提。在此以Apligraf为例加以阐述。

1．建立明确的组织工程皮肤产品使用适应证和禁忌证 任何一种医疗产品都不是万能的，它有一定的适应证和禁忌证。Apligraf把传统治疗无反应、病程超过至少1个月的静脉性溃疡及病程超过3周未累及肌腱、肌肉、筋膜和无骨暴露的糖尿病性溃疡作为适应证。Apligraf不能用于未控制的感染和恶化创面，移植前1周，应使用抗菌药以减少感染风险。已知对胶原和该产品的运输保存液成分过敏者禁用。

2．产品生物安全性检测说明和保证产品说明书必须保证该产品已进行了供体血液和细胞库的HIV－1、HIV－2、HLTV－1、HLTV－2、甲型、乙型、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒检查；细胞库的细菌、真菌、反转录病毒、支原体、染色体异常、生化缺陷等检测；支架材料进行了细菌、真菌、支原体、内毒素检测，胶原还进行了蛋白和氨基酸含量测定。

3．产品的取出方法和使用注意事项取出方法和注意事项是保证组织工程皮肤活力和正确使用的前提。冻存的产品，如Dermagraft，解冻前室温下暴露不超过1min，34～37℃水槽中浸没解冻2min（不超过3min），肉眼无冰晶即可，冲洗4次，每次5s，解冻后室温下30min内必须使用。Apligraf取出时，从支持膜上剥离皮肤，并保持表皮层和真皮层的方向，立即使用。次氯酸钠消毒液、醋酸磺胺米隆、Tincoban、硫酸锌、聚维酮碘、氯己定等消毒药对双层皮肤有毒，移植前后不应使用。

4．操作程序 Apligraf建立的双层活皮肤替代物的移植操作包括6个步骤。

（1）创面移植床的准备：确认创面无感染。彻底清创，清除纤维化及坏死组织以确保移植皮肤与创面紧贴，尽可能使创面无渗出，必要时可用止血药物控制出血。用无菌生理盐水冲洗创面。

（2）确保组织工程皮肤产品活性：该产品是含活细胞的皮肤替代物，并且只有5～10d的保存期，因此使用前有必要评估其活力。取出前应注意检查包装的完整性和产品的有效期，并核对产品的pH，如出现紫色或黄色均不应使用。

（3）取出组织工程皮肤：应在无菌条件下进行。使用无齿镊或木制棉签头从边缘轻轻提起或进入，将其从支撑膜上分离，保持原来的皮肤方向，手托或镊子将其移动到创面床，避免碰到贮藏器皿边缘和皮肤折叠（严重的折叠可在生理盐水中解开）。

（4）移植到创面床：取出后立即移植到准备好的创面，确保真皮面接触创面，修剪多余的皮肤组织（允许与正常皮肤的少量重叠）。用棉签去除皮下的气泡。移植后可在其上打孔，用于创面引流。

（5）原位固定移植的组织工程皮肤：第一层使用不黏敷料覆盖移植的组织工程皮肤。对于静脉性溃疡，第二层使用泡沫压力垫或折叠吸水敷料；对于糖尿病性溃疡，第二层使用压力绷带。根据移植部位的不同可能还需采取额外的固定措施。

（6）术后护理：于术后3～5d可更换第二层敷料，第一层敷料必须保持5～7d，过早去除第一层敷料可能使移植的皮肤随敷料剥脱，以后可每周更换一次或由医师慎重决定，并应注意观察下列情况。

①移植的组织工程皮肤情况及患者的反应：观察移植后的组织工程皮肤外观、成活率及生长情况，及时发现血肿、局部感染、患者局部和全身的异常反应，并正确处理。如血肿应及时局部开窗去除，发生感染应将移植的组织工程皮肤移除。发现患者出现可能与移植相关的不确定严重反应，应及时移除人工皮肤，并积极对症处理。若移植的皮肤未能成活，再次应用至少需要等到6周以后。

②判断有无免疫排斥的发生：皮肤组织有较强的免疫原性，不论何种组织工程皮肤均存在着免疫排斥、异物反应和病毒感染等方面的潜在风险。移植的组织工程皮肤在一定的时期内通过血管化和重建而存在，并通过分泌一些生长因子促进伤口愈合。它能不能在受者体内长期存在还有争议，但多数学者已经认为移植的组织工程皮肤将逐渐被受者自身细胞取代，因而需要观察免疫排斥反应并及时处理。其主要指标有大体成活情况、炎症反应情况，组织学上是否出现KC水肿、脱落和炎性浸润等表现，测定接受移植患者血T4／T8比例、淋巴细胞转化试验、混合淋巴细胞反应等。

③判断创面愈合质量：可以根据以下3方面来简单判断和比较创面的愈合质量。第一，创面愈合率。创面愈合率是评价创面愈合的直接指标之一。先将创面边缘描绘在透明薄膜上，此时计算出的面积为原始面积，然后以同样的方法计算出创面愈合过程中未愈合的面积，并按公式计算伤后不同时相点的创面愈合率，即愈合率＝（原始创面面积－未愈合创面面积）／原始创面面积。第二，创面愈合时间。它是创面完全上皮化所需的时间，是评价创面愈合的传统指标之一。上皮化依靠肉眼观察。第三，组织病理学分析。用组织学方法观察创面愈合情况也是传统的方法之一，证据可靠。一般可以采用组织切片HE染色，通过光学显微镜观察上皮化情况、基底膜带情况及真皮重建情况。可按Eldad制订的标准做定量评价，即在光镜下通过观察表皮结构、真皮－表皮连接处、胶原结构、炎性细胞浸润数量（其中粒细胞为放大400倍时每视野的细胞数）等几个方面来评分，其标准见表1－1。

表1－1　组织学创面愈合质量标准

④愈合后外观和功能评估：一般采用比较观察法，观察皮肤弹性，即与正常皮肤比较指压反应和用示、中指捏起的高度；观察柔软性，即触摸到的质地感觉；观察外观，分为好、一般、差。