原位杂交检测方法远较免疫组化染色复杂，从探针的设计和标记、杂交方法的选择、实验和对照的设计到检测的各个环节都会直接或间接地影响到杂交的结果。在原位杂交实验中可能会遇到的问题也不少，其中直接与杂交相关的问题有以下几点。
1．固定液选择不当 DNA是比较稳定的；mRNA是相对稳定的，但易为酶合成和降解；RNA非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。但在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类、浓度和固定时间十分重要，而且应注意取材后应尽快予以冷冻或固定。
2．蛋白酶处理不当 如酶的浓度过高或消化时间过长等均可导致组织或细胞样本的部分或完全脱落，并不同程度地破坏组织结构。一般而言，未经醛类固定剂固定的细胞样本不需酶消化处理，冷冻组织切片消化酶的浓度应低于石蜡切片。不同的组织、不同类型的探针和杂交方法对酶消化处理的要求都没有统一的界定，需根据具体情况具体对待和处理。
3．杂交信号弱或无信号 从探针的浓度不足到结果检测的各个环节的失误都可能会导致在阳性对照组织上没有信号的情况，即假阴性反应。杂交信号弱的原因有可能是探针的标记不好、探针太长难于渗入细胞、消化不够、探针和（或）靶序列的变性处理欠佳等。实际工作中，导致信号弱的最常见原因是靶序列的暴露不佳，后者常因储存蛋白酶活性的自然变化或不同批次的蛋白酶活性不一等所致。
4．缺乏重复性 导致在原位杂交中不能重复阳性结果的原因有以下两种。
（1）在第二次实验中出现了技术方面的问题。
（2）首次实验产生的是假阳性信号。
因此，在每次实验时，相应的对照设置对实验结果的正确解释是十分重要的。
5．背景染色重 主要原因如下。
（1）非特异性探针附着：对不同种类细胞的附着情况是不同的，以嗜酸性粒细胞更常见；生物素标记的探针可以附着于内源性亲和素，在中性环境中带正电荷的生物素分子可附着于细胞外基质上；有时，＜200bp探针对细胞核的附着也会产生高背景着色。
（2）非特异性抗体和亲和素附着：与免疫组化染色时相似，完全抗体可以非特异地与细胞表面的Fc受体结合，可选择F（ab）2抗体和血清阻断等处理；对于亲和素的附着，可用链亲和素取代亲和素，后者在pH 7时是中性的；也可用脱脂牛奶孵育以减少亲和素的附着。
（3）与探针无关的底物沉着。产生的原因有内源性酶的活动、酶底物的自发转化和底物沉积在样本的非细胞成分等。
6．出现非特异性结果 可能原因是探针浓度过高、非特异性位点没有封闭，或杂交后清洗不完全。
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