直支链淀粉的测定(双波长法)

1.原理

如果溶液中某溶质在两个波长处均有吸收，则两个波长的吸光度差值与溶质浓度成正比。用与待测样品相应的标准品配制的直链淀粉和支链淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描(400～960nm)或作吸收曲线，作图确定直链淀粉的参比波长和测定波长λ1、λ2，支链淀粉的参比波长和测定波长λ3、λ4。再将待测样品与碘显色，在选定的波长处作4次比色，然后利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。因测定的是试样在两波长处的吸光度差值，扣除了两类淀粉吸收背景的相互影响，故可提高测定的灵敏度和选择性。

2.试剂

乙醚或石油醚(沸程30～60℃)，无水乙醇，0.5m L/LKOH溶液，0.1mol/LHCl溶液。

①碘试剂: 称取碘化钾2.0g，溶于少量蒸馏水，再加碘0.2g，待溶解后用蒸馏水稀释定容至100m L。

②直链淀粉标准液: 称取直链淀粉纯品0.1000g，放在100m L容量瓶中，加入0.5mol/L KOH10m L，在热水中待溶解后，取出加蒸馏水定容至100m L，即为1mg/m L直链淀粉标准溶液。

③支链淀粉标准液: 用0.1000g支链淀粉按上述②法制备成1mg/m L支链淀粉标准溶液。

3.仪器

电子分析天平、索氏脂肪抽提器1套、分光光度计、p H计。

4.操作步骤

1)样品处理

将样品自然风干，粉碎过60目筛，用乙醚脱脂，称取脱脂样品0.1g左右(精确至1 mg)，置于50m L容量瓶中。加0.5mol/LKOH溶液10m L，在沸水浴中加热10min，取出，以蒸馏水定容至50m L(若有泡沫采用乙醇消除)，静置备用。

2)直链、支链淀粉测定波长、参比波长的选择

(1)直链淀粉

取1mg/m L直链淀粉标准液lm L，放入50m L容量瓶中，加蒸馏水30m L，以0.1mol/L HCl溶液调至p H3.5左右，加入碘试剂0.5m L，并以蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白，用双光束分光光度计进行可见光全波段扫描或用普通比色法绘出直链淀粉吸收曲线。

(2)支链淀粉

取1mg/m L支链淀粉标准液1m L，放入50m L容量瓶中，以下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。

测定波长与参比波长的选择必须满足两个基本条件: ①与待测组分共存的组分在这两个波长应具有相同的吸收值，以使其浓度变化不影响到测定值; ②待测组分在这两个波长的差值应足够大。如图8-2所示，对于待测组分直链淀粉，可以选择它的最大吸收波长λ2作为测定波长，在这一位置上作一垂直于X轴的直线交于共存组分支链淀粉吸收图谱上某一点，再从这一点画一平行于X轴的直线，在组分支链淀粉碘吸收曲线上便有一个(或几个)交点，此交点的波长作为参比波长λ1，当λ1有几个位置可供选择时，则应当选择最有利的，以使待测组分吸收差值尽可能大。此时，在波长λ2及λ1下，支链淀粉吸收值相等，其浓度变化不影响待测样品中直链淀粉的测定。因而待测组分直链淀粉可选择λ2为测定波长， λ1为参比波长。对于待测组分支链淀粉，按照同样的方法确定其测定滤长λ4及参比波长λ3。

3)双波长直链淀粉标准曲线的制作

吸取1 mg/m L直链淀粉标准溶液0.3 m L，0.5m L，0.7m L，0.9m L，1.1m L，1.3 m L，分别放入6只不同的50m L容量瓶中，加入蒸馏水30m L，以0.1mol/LHCl溶液调至p H3.5左右，加入碘试剂0.5m L，并用蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白，用1cm比色杯在λ1、λ2两波长下分别测定，即得ΔA直=Aλ2-Aλ1。以ΔA直为纵坐标，直链淀粉含量(mg)为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。

图8－2 作图法选择直链、支链淀粉的测定波长、参比波长

4)双波长支链淀粉标准曲线的制作

吸取1mg/m L支链淀粉标准溶液2.0m L，2.5m L，3.0m L，3.5m L，4.0m L，4.5m L， 5.0m L分别放入6只不同的50m L容量瓶中。以下操作同直链淀粉标准曲线的测定。以蒸馏水为空白，用1cm比色杯在λ3、λ4两波长下分别测定其Aλ3、Aλ4，即得ΔA支=Aλ4-Aλ3，以ΔA支为纵坐标，支链淀粉含量(mg)为横坐标，制备双波长支链淀粉标准曲线。

5)样品中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定

吸取样品液2.5m L两份(即样品测定液和空白液)，均加蒸馏水30m L，以0.1mol/L HCI溶液调至p H值至3.5，样品中加入碘试剂0.5m L，空白液不加碘试剂，然后均定容至50 m L。静置20min，以样品空白液为对照，用1cm比色杯分别测定λ2、λ1、λ4、λ3波长下的吸收值Aλ2、Aλ1、Aλ4、Aλ3，得到ΔA直=Aλ2-Aλ1，ΔA支=Aλ4-Aλ3。分别查两类淀粉的双波长标准曲线，即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。两者之和等于总淀粉含量。

5.结果处理

直链淀粉计算公式见式(8-14); 支链淀粉计算公式见式(8-15); 总淀粉含量计算公式见(8-16)。

式中: X1——查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量，mg;

X2——查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量，mg;

m——样品质量，g。

总淀粉(%) =直链淀粉(%) +支链淀粉(%) (8-16)

6.注意事项

因蜡质和非蜡质支链淀粉碘复合物颜色差异较大，在制备双波长支链淀粉曲线时，应根据测定的谷物类型选择不同支链淀粉纯品(蜡质或非蜡质型)。