蛋白质分子变性的名词解释

蛋白质变性（protein denaturation）是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象（如二级结构、三级结构或四级结构）被改变，导致理化性质的改变和生物活性的丧失，而一级结构（氨基酸的排列顺序）不会受到影响的现象。蛋白质的天然结构是各种吸引和排斥相互作用的净结果，由于生物大分子含有大量的水，因此这些作用力包括分子内的相互作用和蛋白质分子与周围水分子之间的相互作用。

变性是一个复杂的过程，在这个过程中有新的构象的出现，这些构象通常是以中间状态的形式，短暂存在的，蛋白质变性后最终会成为完全伸展的多肽结构（无规卷曲）。某些情况下，天然蛋白质的构象即使是只有一个次级键的改变，或一个侧链基团的取向不同，也同样会引起蛋白质的变性。而对于某些天然状态就为伸展结构的蛋白质（如酪蛋白单体）来说，它们的分子却是不易发生变性的。从结构观点来看，蛋白质分子的变性状态是很难被定义的状态。蛋白质分子在结构上的较大变化通常表现为α-螺旋和β-折叠结构的增加，以及随机结构的减少。然而在多数情况下，变性涉及有序结构的丧失。蛋白质的变性程度与变性条件有关，各种变性状态之间的吉布斯自由能差别很小。球蛋白完全变性时，会成为无规卷曲的结构。

蛋白质变性可引起结构、功能和某些性质发生变化。许多具有生物活性的蛋白质在变性后，它们的活性会完全丧失或者部分降低。但是，有的蛋白质适度变性后仍然可以保持原有活性，甚至还会在原有活性的基础上有所提高，这是由于变性后某些活性基团暴露所致。食品蛋白质变性后通常引起溶解度降低或失去溶解性，从而影响蛋白质的功能特性或加工特性。在某种情况下，变性又是有益的。例如，利用豆类中胰蛋白酶抑制剂的热变性，对其进行加热处理后，可以显著提高豆类在动物体内的消化率和豆类本身的生物有效性。部分变性的蛋白质则比其天然状态更易于消化，或具有更好的乳化性、起泡性和胶凝性。热变性也是食品蛋白质产生热诱导凝胶的先决条件。

蛋白质变性对蛋白质的结构、物理化学性质、生物学性质的影响，一般包括：

①分子内部疏水性基团暴露，蛋白质在水中的溶解度降低；

②生物蛋白质的生物活性丧失，如失去酶活性或免疫活性；

③蛋白质肽键的暴露，使得蛋白质易于被蛋白酶类催化而发生水解；

④蛋白质结合水的能力发生改变；

⑤蛋白质分散体系的黏度发生改变；

⑥蛋白质的结晶能力丧失。

蛋白质的变性情况，可通过测定蛋白质的一些性质，如光学性质、沉降性质、黏度、电泳和热力学性质等来反映，也可以用免疫学的方法如酶联免疫吸附法（ELISA）来测定蛋白质的变性情况。

天然蛋白质的变性有时是可逆的，有的是不可逆的。在温和的条件下，蛋白质比较容易发生可逆的变性，而在比较剧烈的条件下，蛋白质将发生不可逆的变性。当稳定蛋白质构象的二硫键被破坏时，则变性的蛋白质就很难复性了。发生可逆变性的蛋白质，当引起其变性的因素被解除后，蛋白质能恢复到原状的过程称为蛋白质的复性（renaturation）。

引起蛋白质变性的因素有物理因素和化学因素两大类。常见的有温度、机械处理、pH值、化学试剂和辐射等。

一、蛋白质的物理变性

1.加热

加热是引起蛋白质变性最常见的物理因素，也是食品加工中常用的处理方法。蛋白质加热到一定温度，会发生变性，这个温度叫做蛋白质的变性温度。蛋白质经过热变性后表现出相当程度的伸展变形，而且会影响食品的功能特性。

蛋白质在加热时，稳定其结构的氢键作用力被破坏，分子发生伸展使得一些疏水性残基和反应基团暴露，可以导致蛋白质分子间的聚集反应。许多化学反应的温度系数为3～4，即反应温度每升高10℃，反应速度将增加3～4倍。但是，蛋白质变性的温度系数为600左右，即温度每升高10℃，变性速度将增加600倍左右。这个性质在食品加工中有很重要的应用价值，如高温瞬时杀菌（HTST）和超高温瞬时杀菌（UHT）技术就是利用高温能大大加快蛋白质的变性速度，短时间内能破坏生物活性蛋白质或微生物中的酶，同时因为食品中其他营养素化学反应的速度变化相对较小而确保损失较少。一些变化的活化能及温度的相关性如表3-11所示。

表3-11　一些变化的活化能以及温度相关性

影响蛋白质的热变性的因素有很多，例如蛋白质的组成、浓度、水分活度、pH值和离子强度等。大多数的蛋白质在低温下比较稳定，分子中含有较多的疏水性氨基酸的蛋白质要比含有较多的亲水性氨基酸的蛋白质稳定，即蛋白质平均疏水性、疏水性氨基酸分布与蛋白质的变性温度相关。如表3-12所示。

表3-12　一些蛋白质的热变性温度（Td）与其平均疏水性

蛋白质的变性温度与水分的关系表明，生物活性蛋白质在干燥状态下比较稳定，对温度变化的承受能力较强，而在湿热状态下容易发生变性。在一些大豆产品的加工过程中，例如豆粕需要经过水蒸气脱除溶剂，或者是大豆粉采用高温处理破坏其抗营养因子，均是考虑到水对蛋白质变性的影响作用。

在间接利用ELISA对牛半膜肌和收缩肌提取物进行研究时，发现加热时间30min、加热温度40℃时，提取物中的蛋白质开始失去抗原性，在70℃时有近50%的蛋白质失去抗原性，在100℃时则有70%以上的蛋白质失去抗原性，如图3-13所示。回归分析发现加热后蛋白质抗原性的保留率与加热温度负相关。由于加热至40℃时已经发现蛋白质变性，所以ELISA技术对蛋白质变性的评价可能比其他技术更灵敏。

表3-13　加热对牛后半膜肌和收缩肌提取物的变性影响

2.冷冻

低温处理也可以导致某些蛋白质的变性。低温可以改变蛋白质的水合环境，破坏维持蛋白质结构的作用力的平衡，同时一些基团的水化层也被破坏，基团之间的作用力引起蛋白质的聚集或者亚基重排；较低温度时体系结冰后的盐效应也会导致蛋白质变性。另外，冷冻引起浓缩效应，可能导致蛋白质分子内、分子间的二硫键交换反应增加，从而导致蛋白质变性。

肌红蛋白在30℃显示出最大的稳定性，一旦温度低于0℃，就会发生变性；L-苏氨酸胱氨酸酶在室温下稳定，但在0℃时不稳定；11S大豆蛋白质、乳蛋白在冷却或冷冻时可以发生凝集和沉淀，这也是蛋白质低温变性的典型例子。但是，低温也能引起某些低聚物解离和亚单位重排。脱脂牛乳在4℃保藏时，β-酪蛋白会从酪蛋白胶束中解离出来，从而改变胶束的物理化学性质和凝乳性质。乳酸脱氢酶和甘油醛磷酸脱氢酶在4℃条件下，由于其亚基的解离，会失去大部分活性，如果将其移至室温下保温数小时后，亚基又重新缔合为原来的天然结构，并恢复其原有的活性。

3.机械处理

揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械剪切处理，都能引起蛋白质变性。剪切速率越高，蛋白质变性的程度则越大。同时，如果蛋白质受到高温和高速剪切力共同处理，它往往会发生不可逆变性。在pH值为3.5～4.5、温度为80～120℃的条件下，浓度为10%～20%的乳清蛋白经过7500～10000个/s的剪切速度处理后，就可以形成蛋白质脂肪代用品，如具有润滑和乳状液口感的冰淇淋等就是运用这种方法制备的。

4.静高压

球状蛋白质分子内部存在空穴，具有柔顺性和可压缩性，高压可以导致这类蛋白质变性。光学性质表明，大多数蛋白质在100～1000MPa压力范围作用下才会产生变性。当压力很高时，一般在25℃即能发生变性。由于高压而导致的蛋白质的变性或酶的失活，在高压消除以后会重新恢复。

高压加工的方法优于热加工方法，它不会损害蛋白质中的必需氨基酸、天然色泽和风味，也不会导致有毒化合物的生成。对肉制品进行高压处理还可以使肌肉组织中的肌纤维裂解，从而提高肉制品的品质。因此，高压技术是食品高新加工技术之一。

5.辐射

高能射线可被芳香族氨基酸残基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）所吸收，导致蛋白质构象的改变，同时还会使氨基酸残基发生各种变化，如共价键的破坏、分子离子化、分子游离基化等。所以辐射不仅可以使蛋白质发生变性，还可能因结构的改变而导致蛋白质的营养价值变化。

但是，运用于食品保鲜时，辐射对食品蛋白质的影响极小，一是由于食品处理时使用的辐射剂量较低，二是食品中存在水的裂解而减少了其他物质的裂解。

6.界面作用

蛋白质分子在水和空气、水和非水溶液或固相等界面吸附时，一般会发生不可逆变性。一般认为，蛋白质在界面的吸附包括界面吸附和变性两个阶段。蛋白质大分子向界面扩散的过程中，蛋白质可能与界面高能水分子发生相互作用，致使蛋白质—蛋白质之间的氢键遭到破坏，结构发生“微伸展”，蛋白质在界面进一步的伸展和扩展，而亲水和疏水残基分别在水相和非水相中取向，从而引起蛋白质变性。蛋白质吸附速率与其向界面扩散的速率有关，当界面吸附的变性蛋白质达到饱和时，吸附立即停止。

二、蛋白质的化学变性

1.pH值

蛋白质所处介质的pH值对变性过程有很大的影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低，在中性pH环境中，除少数几个蛋白质带有正电荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。几种蛋白质的等电点如表3-14所示。

表3-14　几种蛋白质的等电点（pI）

酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间因静电作用形成的键。在中性pH值附近，静电排斥的净能量小于其他相互作用，大多数蛋白质是稳定的，然而当pH值超出4～10范围就会发生变性。在极端pH值时，蛋白质分子内的离子基团产生强静电排斥，促使蛋白质分子伸展和溶胀。

2.盐类

在蛋白质溶液中加入中性盐后，因中性盐浓度的不同可产生不同的反应。低浓度盐可使大多数蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用（salting in）。由于低浓度盐可促使蛋白质表面吸附某种离子，导致其颗粒表面同性电荷数目增加而排斥力增强，同时与水分子作用也增强，从而提高了蛋白质的溶解度。当蛋白质处于高盐浓度环境时，蛋白质的水化层会遭到破坏，并且分子中的电荷会被中和，蛋白质颗粒随即相互聚集而沉淀，这种现象称为盐析作用（salting out）。

不同的蛋白质因分子大小、电荷多少的不同，盐析时所需盐的浓度也各异。混合蛋白质溶液可用不同浓度的盐使其分别沉淀，这种方法称为分级沉淀。盐析常用的无机盐有（NH4）2SO4、NaCl和Na2SO4。在等离子强度条件下，各种阴离子影响蛋白质结构稳定性的能力遵循下列顺序：F-＜SO42-＜Cl-＜Br-＜I-＜ClO4-＜SCN-＜Cl3CCOO-。这个顺序称为感胶离子序（Hofmeister series）或离液序列（chaotropic series）。采用盐析法沉淀分离蛋白质的优点是沉淀出来的蛋白质不会发生变性。因此，中性盐沉淀法常用于酶、激素等具有生物活性的蛋白质的分离制备。

金属离子能够与蛋白质分子中的某些基团结合形成难溶的复合物，同时破坏了蛋白质分子的立体结构而造成蛋白质的变性。碱金属如Ca2+、Fe2+、Cu2+和Mg2+可以成为某些蛋白质分子中的一个组成部分。一般用透析法或螯合剂可将金属离子从蛋白质分子中除去，但这将明显降低这类蛋白质对热和蛋白酶作用的稳定性。过渡金属例如Cu2+、Fe2+、Hg2+和Ag+等容易与蛋白质发生作用，其中许多能与巯基形成稳定的复合物，从而使蛋白质变性。卤水点豆腐就是一个典型的例子，金属离子致使大豆蛋白质分子发生变性，凝集后形成豆腐。

3.有机溶剂

在蛋白质溶液中加入一定量的能与水互溶的有机溶剂（organic solvents），如酒精、甲醇、丙酮、甲醛等，会致使蛋白质颗粒聚集而沉淀。因为有机溶液降低了溶液的介电常数，使蛋白质分子内基团间的静电力增加；或者是破坏、增加了蛋白质分子内的氢键，改变了稳定蛋白质构象原有的作用力情况；或是进入蛋白质的疏水性区域，破坏了蛋白质分子的疏水相互作用。

低浓度的有机溶剂对蛋白质结构的影响较小，一些甚至具有稳定作用。而在高浓度的有机溶剂存在的条件下，所有的有机溶剂均能对蛋白质产生变性作用。例如以脱脂大豆粉为原料，采用水—乙醇混合物提取其中的可溶性糖类化合物（低聚糖）和无机盐制备的大豆浓缩蛋白。按此法得到的大豆浓缩蛋白的溶解度一般偏低，这显然是因为有机溶剂乙醇致使部分大豆蛋白变性的缘故。如果在低温下操作可以减轻或避免有机溶剂造成的蛋白质变性现象。

4.有机化合物水溶液

某些有机化合物水溶液，例如4～8mol/L的尿素和胍盐（guanidine salts）的高浓度水溶液，能致使氢键断裂，从而使蛋白质发生不同程度的变性。同时，还可通过增大疏水性氨基酸残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。

在室温下，4～6mol/L尿素和3～4mol/L盐酸胍，可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点，而8mol/L尿素和约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态。尿素易于同蛋白质结合形成新的氢键。盐酸胍的作用与尿素相似，能破坏氢键，使巯基暴露。尿素和盐酸胍引起的变性通常是可逆的。但是在某些情况下，由于一部分尿素可以转变为氰酸盐和氨，而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应改变蛋白质的电荷分布。现在它们被广泛用于检测蛋白质的可伸展性和构象的稳定性。

5.表面活性剂

表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）是一种很强的变性剂。SDS浓度在3～8mmol/L范围内可引起大多数球状蛋白质变性。SDS在蛋白质的疏水区和亲水环境之间起着媒介作用，除了可以破坏蛋白质分子内的疏水相互作用外，还能与蛋白质分子强烈地结合，在接近中性pH时使蛋白质带有大量的净负电荷，从而增加蛋白质内部的斥力，促使天然蛋白质伸展趋势增大，这也是SDS类表面活性剂能在较低浓度下使蛋白质完全变性的原因。同时，SDS类表面活性剂诱导的蛋白质变性是不可逆的。

6.还原剂

巯基乙醇（HSCH2CH2OH）、半胱氨酸、二硫苏糖醇等还原剂，由于具有—SH基，能使蛋白质分子中存在的二硫键被还原，破坏蛋白质的结构，从而改变蛋白质的原有构象，导致蛋白质的不可逆变性。

HSCH2CH2OH+—S—S—→Pr—S—SCH2CH2OH+HS—Pr

一些化合物对蛋白质变性的影响如表3-15所示。

表3-15　一些化合物对β-乳球蛋白变性的影响

对于食品加工而言，蛋白质的变性一般来讲是有利的，但在某些情况下蛋白质的变性又必须避免，如在酶的分离、牛乳的浓缩过程中，蛋白质由于过度变性会导致酶的失活或蛋白质沉淀，这些变化是生产所不希望的。