显微镜的分辨率

11.3.3　显微镜的分辨率

以上主要从几何光学的观点讨论了显微镜光学结构的基本特点和性质，目的是解决显微镜的初始光学结构设计。但对观察微小物体细节的显微镜来说，分辨本领是其最重要的性能指标之一。由于显微镜的分辨率很高，往往其数量级可和波长相比拟，因此在讨论显微镜成像问题、特别是评价显微镜的成像质量以及确定与之相关的显微系统光学性能参数（如放大率等）时，还必须从光的波动理论出发进行研究，才能得出切合实际的结果。

显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力，它主要由显微物镜的性能决定。通常是以显微物镜的分辨率即显微物镜能分辨开两个物点的最小距离δy来表示，δy值越小，则显微镜的分辨能力越强。

显微镜是一种衍射极限光学系统，物体显微结构的成像过程，可以视为光通过物体和显微镜光学系统时产生的衍射和干涉效应的结果。因此，对显微系统分辨率的计算是建立在衍射理论的基础上，且应区分对发光点和非发光物体两种不同情况的分辨。

1）对两个发光点的分辨率

按照瑞利判据，在理想成像条件下，对于两个自发光点（即认为各点发出非相干光），在显微物镜像平面上两个像点刚好能被分辨开的最小距离δy＇应等于其艾利斑的半径，即为：

式中：D——入瞳直径；

　　　l＇——像点至物镜（入瞳）中心的距离；

　　　u＇——物镜像方孔径角（见图6.16）。

由于显微物镜的成像满足正弦条件，即有

nδysinu=n＇δy＇sinu＇

将上述正弦条件代入式（11.11），且有n＇=1，则得到

上式中δy即为显微镜物平面上能被分辨的两发光点的最小距离。

2）对不发光物体的分辨率

实际显微镜中的成像情况要更为复杂。通常被观察的标本并非自发光体，而是由外加光源与照明系统照明的。标本各点的像是由光源（非点光源）发出的光线照射标本后，由标本上各点的散射或衍射形成的。

阿贝研究并创立了不发光物体的成像理论。按照这一理论，当用显微镜观察被照明物体的精细结构时，物体对所通过的光束的作用类似于衍射光栅，因此衍射作用对于像的形成具有决定意义。阿贝所建立的不发光物体分辨率公式，就是选择由许多平行的明暗交替条纹构成的最简单的衍射光栅作为显微物镜的理想标本成像而导出的。

根据衍射理论，在垂直的相干光照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为

在倾斜照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为

式中λ是所采用的照明光的波长。

表11.1是采用λ=0.555μm的绿光照明时，按式（11.14）计算得到的不同数值孔径物镜的分辨率值。

表11.1　不同数值孔径显微物镜的分辨率值

式（11.11）～式（11.14）表明，显微镜的分辨率具有波长的数量级，其具体数值取决于照明光的波长和显微物镜的数值孔径。因此，为提高分辨本领，可采用短波长的光照明。例如，紫外线显微镜、x射线显微镜以及电子显微镜等都是提高显微镜分辨本领的有效途径。

图11.6　物方不同介质条件下的数值孔径变化

提高分辨率本领的更主要途径是增大显微镜的数值孔径，即可通过提高物方折射率和增大物方孔径角来达到。以透射式生物显微镜为例，对于物方（盖玻片与物镜前透镜之间）介质为空气的物镜（通常称为“干系物镜”），其最大数值孔径为1，对应的物方孔径角u₀（即玻璃－空气界面上的全反射临界角）约为41°。实际上干系物镜的数值孔径最大不能超过0.95，由n₀sinu₀=nsinu可知，其相应的u₀和u角值分别为39°和72°（见图11.6（a））；增大数值孔径的另一个重要手段是增大n值，使之大于1。为此采用浸液物镜，即在盖玻片和物镜的前透镜之间充以液体，如图11.6（b）所示。当以水作浸液时，在盖玻片与浸液的界面上发生全反射的临界角约为61.5°，由工作距离和透镜直径所限定的角u值实际上可以达到64°，因而水浸物镜的最大数值孔径可达

NA=nsinu=1.33×sin64°=1.20

实际上更多采用的是n=1.5～1.6的浸油，如甘油（n=1.455）、杉木油（n=1.515）等。其中，以杉木油用得最多，因其折射率与盖玻片及物镜前透镜基本相同，光线在界面上既不产生折射，也不发生全反射。此时，最大孔径角u可达67°，相应数值孔径可达1.40；进一步采用高折射率浸油（如二碘甲烷n=1.741）可使数值孔径最高达到1.6。比较图11.6（a）和图（b）可以看出，采用浸液物镜比采用干系物镜可以得到更大的数值孔径。