反胶束萃取胰蛋白酶

一、目的要求

1．加深对反胶束萃取原理的理解。

2．了解反胶束萃取工艺过程及影响因素。

3．研究p H值和盐离子强度对萃取率和反萃取率的影响规律，求出适宜的萃取p H值和离子强度。

二、实验原理

反胶束萃取技术是近几年来发展的具有开发前景的新型分离技术。它是由表面活性剂分散在有机溶剂（连续相）中，自发形成纳米级的聚集体，称反胶束（或称反胶团）。在反胶束溶液中，组成反胶束的表面活性剂定向排列，其非极性尾向外伸入非极性有机溶剂主体中，而极性头向内排列，形成一个极性核，核内充满水溶液，具有溶解蛋白质之类大分子物质的能力。当含反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电引力、疏水作用力或亲和力等推动力作用下溶入极性核中，从而被萃取，然后再控制适当的条件，使蛋白质从负载有机相中重新反萃取到水相，达到纯化目的。

影响反胶束萃取的因素很多，主要有水相溶液的 p H 值、离子强度、表面活性剂和有机溶剂的种类与浓度、温度等。

胰蛋白酶广泛存在于动物的胰中，分I型和II型两种，其相应前体分别为胰蛋白酶原I （CTN）和胰蛋白酶原II（ATN）。正常胰液中胰蛋白酶原占总蛋白质含量的19%，CTN是ATN的2倍。

一般通过有机溶剂或硫酸铵沉淀法制得胰酶粗品。本实验利用阴离子型表面活性剂AOT在异辛烷中形成的反胶束系统对胰酶粗提物中的胰蛋白酶进行提取，使胰蛋白酶的纯度得到较大提高。由于 AOT 是具有双链、极性头较小的表面活性剂，所以堆砌率高，在异辛烷中能自发形成反胶束溶液。

三、仪器与试剂

1．仪器

循环水式真空泵、布氏漏斗、吸滤瓶、水浴恒温振荡器、酸度计、电子台秤、具塞三角瓶、10 m L刻度离心试管、离心机、量筒、烧杯、吸管或可调式移液管等。

2．试剂

胰酶粗提物、AOT（琥珀酸二酯磺酸钠、>96.0%）、BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯、>98.0%、生化试剂）、异辛烷、乙醇、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硅藻土和透析袋等。

四、实验操作与步骤

1．反胶束相系统的萃取操作

（1）不同p H值对萃取的影响。

① 配制缓冲液：分别配制p H5.8、6.4、6.8、7.2、7.6的0.01 mol/L Na2HPO4 /Na H2PO4缓冲液，其中KCl含量均为0.06 mol/L。

② 配制酶液：分别称取0.5～2 g的猪胰酶粗提物干粉，加入100 m L上述不同p H值的缓冲液中，控制胰蛋白酶的酶活均为200～300 U/m L，磁力搅拌30 min，使酶得到充分溶解。再加入1%硅藻土作为助滤剂，真空抽滤，得到澄清的酶溶液。

由于粗酶粉的溶解会改变溶液中的p H值，所以要用上述对应的缓冲液分别进行透析：将酶液装入透析袋中，两头扎紧，吊在缓冲液中，冰箱放置，经多次换液后，使达到萃取所要求的p H值。透析后的酶溶液即可用于萃取。萃取前取样测定其酶活（U/m L）和蛋白质浓度，计算比活（U/mg）。

③ 配制含15%（V/V）乙醇的0.1 mol/L AOT/异辛烷反胶束相：称取4.4 g AOT溶于少量异辛烷中，加入15 m L无水乙醇，再用异辛烷定容至100 m L，形成无色透明的溶液。

④ 萃取：分别吸取不同p H值的酶溶液5 m L和等体积的15%乙醇的0.1 mol/L AOT/异辛烷反胶束相于3只具塞三角瓶中，置于25℃恒温摇床中，250 r/min振荡10 min，使达到萃取平衡，胰蛋白酶充分转移至反胶束团中。

⑤ 将充分混合的反胶束溶液倒入10 m L刻度离心试管中，用离心机离心（4 000 r/min，离心10 min），使分离成上、下两相。记录上、下相的体积（m L），并测定水相（下相）的酶活。

按下式计算萃取率：

式中 U0和V0——初始酶液的酶活（U/m L）和体积（m L）；

U1和V1——萃取后下相的酶活（U/m L）和体积（m L）。

（2）KCl离子强度对萃取的影响。

① 配制缓冲液：在上述已配制p H7.2的0.01 mol/L Na2HPO4/Na H2PO4缓冲液中，分别加入不同量KCl，溶解，使含量分别为0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L。

② 配制酶液：称取0.5～2 g的猪胰酶粗提物干粉，分别加入100 m L上述不同KCl含量的缓冲液中（控制胰蛋白酶的酶活均为200～300U/m L），磁力搅拌30 min，使酶得到充分溶解。再加入1%的硅藻土作为助滤剂，抽滤，得到澄清的酶溶液。用上述对应的KCl缓冲液分别进行透析，并多次换液使达到萃取所要求的p H7.2的数值。萃取前取样测定其酶活（U/m L）和蛋白质含量，计算比活（U/m L）。

以下的萃取操作均与上述相同。

2．反胶束系统的反萃取操作

配制p H10.1～10.3的0.05 mol/L Na2CO3/Na HCO3反萃取缓冲液，其中含4%（V/V）乙醇和1.2 mol/L KCl。

在萃取离心后的上层有机相中分别加入等体积的上述反萃取缓冲液，25℃恒温摇床250 r/min振荡10 min，充分混合，使胰蛋白酶转入水相。

将充分混合的上述溶液分别倒入10 m L刻度离心试管中，用离心机离心（4 000 r/min，离心10 min），使分离成上、下两相。记录上、下相的体积（m L），并分别测定反萃取液（下相）的酶活。按下式计算反萃率：

式中 U2和V2——反萃液的酶活（U/m L）和体积（m L）。

根据原酶液和反萃液中蛋白质含量以及酶活，计算胰蛋白酶比活（U/mg蛋白）。

五、实验结果和讨论

1．分别列表记录在不同p H值和KCl浓度下，实验所得萃取率和反萃率的数据。

2．以萃取率和反萃率为纵坐标、萃取缓冲液中KCl浓度为横坐标，制作KCl浓度对萃取率和反萃率的影响曲线图。总结其规律，并从理论上解释原因。

3．根据萃取前酶液的比活和反萃取后反萃液的比活，计算经反胶束萃取后，胰蛋白酶纯度（比活）的提高倍数。