分装与保存

实验实训四　MS固体培养基的配制、分装与保存

一、实验实训目的

能准确计算母液、蔗糖、琼脂的用量，并掌握MS固体培养基的配制与灭菌技术。

二、实验实训材料与用品

MS培养基的各种母液、生长调节物质母液、琼脂、蔗糖、天平、蒸馏水、移液枪、量筒、定容瓶、电炉或电磁炉、酸度计或pH试纸、0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCl、培养瓶、标签、笔等。

三、实验实训步骤

（一）培养基的配制

1.计　算

计算各种母液的用量（按配制1 000 mL MS培养基计算）。

根据配方计算母液用量，以此配方为例：1 L MS+NAA0.5 mg/L +6-BA 2 mg/L +3%蔗糖+0.7%琼脂，pH=5.8，并将MS母液、生长调节物质母液放大倍数，蔗糖、琼脂用量浓度以及培养基配制的体积数填入表2-8中。

将计算得到的量填入表2-8中。

表2-8　MS固体培养基配制表

2.量　取

在烧杯中加培养基体积30% 的蒸馏水，分别移取母液加入烧杯中，用天平分别称量蔗糖和琼脂。

3.定　容

将称量好的蔗糖倒入母液中搅拌，使其完全溶解，移入容量瓶内，并淋洗烧杯2次，同样移入容量瓶，定容。

4.熬　制

将定容的溶液倒入锅内，留少部分溶液润湿琼脂，淋洗2次倒入锅内，熬制，直至琼脂完全溶解；也可不用熬制，定容后调节pH，直接分装，利用高压灭菌的温度溶解琼脂，但在分装时，一定注意琼脂要分装均匀，以免部分培养基硬或部分培养基不凝固。

5.调节pH

用0.1 mol/L的NaOH或0.1 mol/L的HCl调节pH，将其调节至6.0。

6.分装与封口

将配好的培养基尽快分装到培养瓶中，分装时要掌握好培养基的量。培养基分装时，一般占试管、三角瓶等培养容器的1/5～1/3为宜；若为塑料瓶，则培养基的厚度一般以2 cm厚为宜。分装时要注意不要将培养基溅到瓶口，以免引起污染，分装后的培养基应尽快盖上盖子封口。

分装后应立即灭菌，若不及时灭菌应保存在冰箱中，24 h内完成灭菌工作。

（二）灭　菌

培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的理想场所。分装好的培养基要及时灭菌，不然很快便滋生霉菌，影响培养效果。而接种材料需在无菌的条件下培养很长时间，如果培养基被微生物所污染便达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌是植物组织培养中十分重要的环节。培养基灭菌的方法有多种，主要用高压蒸汽灭菌法，具体方法如下：

（1）打开锅盖，加水至水位线，维持高水位线的灯是亮的。

（2）把已装好培养基的培养瓶放入锅筒内，同时还可将需要灭菌的接种工具、包扎好的细菌过滤器、包好的滤纸（制作无菌滤纸）、罐装好的蒸馏水（制作无菌水，不超过容器体积的2/3）等放入灭菌锅内。

（3）然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝，时间调至规定时间（如25 min），接通电源加热。

（4）当压力升至0.05 MPa时，关闭电源，打开放气阀放气；当压力回到“0”时，关闭放气阀，灭菌培养基时需放2次冷气；当气压上升到0.105 MPa时，温度在121 °C，开始计时，保持灭菌规定时间（25 min），25 min后关闭电源，缓缓打开放气阀。

（5）当压力降至“0”时，打开锅盖，取出培养基和灭菌物品，培养基放于平台上冷凝。如没有熬制的培养基，在取出时应轻轻晃动培养瓶，使琼脂混合均匀。

（三）培养基的保存

灭菌好的培养基放置在干净、整洁无污染的地方保存，配制好的培养基应尽快使用，一般培养基的使用不超过2周。

【知识拓展】

（1）生长调节物质遇热不稳定，应使用过滤灭菌法，不应进行高压灭菌；（2）培养基灭菌后，需在培养室内预培养3 d，若无污染，证明培养基可用，最好在2周内用完，最长不超过1个月，含吲哚乙酸或赤霉素的培养基1周内用完，暂时不用的放置在10 °C或4～5 °C的冰箱内保存。

四、作　业

将本次实验实训内容整理成实验实训报告。