组织细胞凋亡检测

凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA。单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可特异地原位显示出凋亡细胞。

（一）酶标记法

1.材料与试剂

（1）过氧化物酶标记的抗体。

（2）反应缓冲液。

（3）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）。

（4）反应终止/洗涤液。

（5）平衡Buffer液。

（6）蛋白酶K（20μg/ml）消化液。

（7）3%H2O2。

（8）DAB显色液。

（9）苏木素染色液。

（10）抗体稀释液。

2.操作方法

（1）石蜡切片常规脱蜡入水，4%多聚甲醛10min。

（2）3%H2O2室温孵育10min。

（3）PBS液洗。

（4）蛋白酶K，37℃温箱孵育10～20min，PBS液洗。

（5）滴加平衡缓冲液，室温孵育10min。

（6）滴加反应液，置于37℃湿盒中孵育45min。

（7）PBS液洗3次，每次3min。

（8）滴加辣根过氧化物酶标记的抗体，室温孵育30min。

（9）PBS液洗3次，每次5min。

（10）滴加DAB显色液，镜下观察5～10min。

（11）水洗涤3次，每次2min。

（12）苏木素核染色5～10min。

（13）水洗3次，每次2min。

（14）梯度酒精脱水、二甲苯透明。封片。

（15）细胞核呈蓝色，凋亡的细胞核呈棕黄色（图3-21）。

图3-21　TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡（×400）

参考文献

[1]Qiao X,Chen X,Wu D,et al.Mitochondrial Pathway Is Responsible for Aging-Related Increase of Tubular Cell Apoptosis in Renal Ischemia/Reperfusion Injury.J Gerontol A Biol Sci Med,2005,60:830-839.

[2]Jiang H,Zhu H,Chen X,et al.TIMP-1 Transgenic Mice Recover From Diabetes Induced by Multiple Low-Dose Streptozotocin.Diabetes,2007,56:49-56.