普通-技术

（一）实验目的与实验原理

由于PCR技术无法直接扩增mRNA，因此，需要利用逆转录的方法将mRNA变成cDNA，而后再进行PCR扩增。通过扩增特异性基因片段，得到mRNA表达水平。

（二）实验材料

M-MLV逆转录酶，Taq酶，dNTP，无RNA酶H2O等。

（三）实验方法

1.RT反应

（1）取2～5μg总RNA，补充H2O至10～15μl，70℃变性5min，冰浴5min。

（2）按以下成分配制混合液，混匀（表2-1）。

表2-1　混合液的配制

（3）37～42℃孵育60min（如用随机引物，用37℃孵育60min）。

（4）85℃加热5min使逆转录酶失活。建议将RT产物，用水稀释5倍后，取1μl作为PCR模板。

2.PCR反应

（1）配制PCR反应混合物（表2-2）。

表2-2　PCR反应混合物的配制

（2）设定PCR反应程序，进行反应。

PCR循环

（四）注意事项

1.目前市售的Taq酶品种繁多，如高保真Taq酶，长片段扩增Taq酶，热休克Taq酶等，这些Taq有不同的功能，在选用时要注意其适用范围。此外，目前也出现了“傻瓜式”的PCR试剂盒，这些试剂盒将PCR反应中除模板和引物以外的成分进行了混合，方便操作，实验者可以根据实际情况进行选用。

2.PCR反应受多种因素影响，如退火温度，Mg离子浓度，引物等，因此需要在实践中优化PCR反应条件，得到特异性条带。

3.由于PCR反应非常敏感，在实验中需要注意污染和假阳性。

（五）主要问题及解决方法

1.为什么没有扩增出条带？

答：这个现象比较常见，通常这种情况与以下问题有关：①模板是否有问题，浓度是否足够；②退火温度是否合适；③镁离子浓度是否足够（虽然大部分Taq酶所带的buffer含有一定量的镁离子，但是在某些情况下仍需要适当添加镁离子，这样有助于提高PCR扩增效率）；解决方法：增加模板量，提高镁离子浓度（可以增加1倍），降低退火温度（可以参考引物的Tm值，通常退火温度与Tm值相差1～3℃）。如果改变上述条件都无效的话，则需要考虑引物设计是否合理，最好更换新的引物。建议实验者最好从国外的文献上寻找引物序列，这些序列已经被发表者验证有效，而且有现成的实验条件，可以避免许多弯路。

2.为什么扩增出许多条带（图2-4）？

图2-4　RT-PCR检测TIMP-1基因mRNA表达水平

M.Marker；1～8.不同样本扩增结果，由于扩增条件没有优化，除了扩增出来TIMP-1基因，还有非特异性的扩增

答：这个现象通常与非特异性扩增有关，主要原因有模板浓度过高、引物使用量太低、退火温度低、镁离子浓度过高以及引物设计不合理等。解决方案：减少模板使用量、增加引物量、提高退火温度及降低镁离子浓度。如果改变上述条件也无法去除非特异性条带，此时就需要更换引物。

3.如何利用RT-PCR进行mRNA表达的半定量分析？

答：在科研工作中，经常会利用RT-PCR进行mRNA表达的半定量分析。这里需要注意以下几点：要设立内参照（如β-actin，GAPDH等）；要将循环数控制在指数扩增期；模板量不要太高或者太低（根据扩增效率调整，以扩增产物的亮度适度为宜）等。需要注意的是，RT-PCR只能做半定量分析，如果需要进行精确定量分析，则需要使用实时荧光定量PCR技术。

（六）结果示例

本部分提供的是利用RT-PCR方法检测MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平的结果（图2-5）。

图2-5　半定量RT-PCR检测MMP-2和MMP-9的mRNA水平

1.没有任何刺激的细胞；2.凝血酶刺激(0.05NIHU/ml)；3～5.纤维蛋白刺激(0.5mg/ml，1.0mg/ml和2.0mg/ml)