微生物遗传的物质基础

微生物遗传的物质基础_微生物学

遗传必须有物质基础，也即遗传信息必须由某些物质作为携带和传递的载体。现已肯定这个物质基础在绝大多数生物体中就是脱氧核糖核酸（DNA）。

（一）遗传物质DNA的分子结构及其多样性

一般认为DNA的双螺旋分子结构是一律的（见图6-1），是由4种脱氧核糖核酸变化排列组成的大分子。但各种生物DNA的4种碱基（base）含量往往是不均等的，在各种生物中这4种碱基的含量之比反映着种的特性。表6-1表明了几种微生物的碱基成分，从表可见各种DNA分子碱基含量的差异和共同点。各种微生物中的A＝T，G＝C。A为腺嘌呤核苷（aden-osine），T为胸腺嘧啶核苷（thymidine），G为鸟嘌呤核苷（guanosine），C为胞嘧啶核苷（cyti-dine）。但（G＋C）／（A＋T）则随着微生物的种类不同而不同，这数值小到0.45，大到2.73。

表6-1 几种微生物的DNA碱基含量比较

按照沃森-克里克（Watson-Crick）DNA分子结构模型，碱基含量比值的这些特点说明：①DNA两个单链的相对位置上的碱基有严格的配对关系，一条单链上嘌呤的相对位置上必定是嘧啶，一条单链上嘧啶的相对位置上必定是嘌呤；②A的相对位置上必定是T，G的相对位置上必定是C；③DNA链上的碱基对（base pair，bp）排列则没有一定规律。例如在表6-1中的第1、2两种细菌的DNA分子中，AT碱基对多于GC碱基对约1倍；第3、4两种细菌中，两者几乎相等；第5、6两种细菌中则GC碱基对多于AT碱基对约1倍。可见DNA分子中4种碱基的排列绝不是单调重复，DNA结构的变化是无穷无尽的，具有高度多样性。

（二）遗传物质在微生物中存在的多样性

1.遗传物质在微生物中存在的主要形式———染色体

染色体是所有生物（真核微生物和原核微生物）遗传物质DNA的主要存在形式。但是不同生物的DNA相对分子质量、碱基对数、长度等很不相同（见表6-2）。总趋势是：越是低等的生物，其DNA相对分子质量、碱基对数和长度越小，相反则越长。即染色体DNA的含量，真核生物高于原核生物，高等动植物高于真核微生物。而且真核微生物和原核微生物的染色体有着明显的如下区别：①真核生物的遗传物质是DNA，原核生物的遗传物质是DNA，病毒的遗传物质是DNA或RNA；②真核生物的染色体由DNA及蛋白质（组蛋白）构成，原核生物的染色体是单纯的DNA；③真核生物的染色体不止一个，呈线形，而原核微生物的染色体往往只有一个，呈环形；④真核生物的多条染色体形成核仁并为核膜所包被，膜上有孔，可允许DNA大分子物质进出，而原核微生物的染色体外无膜包围，分散于原生质中。

图6-1 DNA分子的化学结构组成

表6-2 一些真核生物和原核生物的染色体DNA

注：真核生物的染色体DNA按单倍体计。

2.真核微生物中染色体外的遗传物质———细胞器DNA

细胞器DNA是真核微生物中除染色体外遗传物质存在的另一种重要形式。真核微生物具有的细胞器包括叶绿体（chloroplast）、线粒体（mitochondrion）、中心粒（centrosome）、毛基体（kinetosome）等。这些细胞器都有自己的独立于染色体的DNA。这些DNA与其他物质一起构成具有特定形态的细胞器结构，并且携带有编码相应酶的基因，如线粒体DNA携带有编码呼吸酶的基因，叶绿体DNA携带有编码光合作用酶系的基因。这些细胞器及其DNA具有某些共同特征：

（1）结构复杂而多样。各种真核生物的染色体或者同一生物的各个染色体虽然在长短大小上常不相同，但是其结构都基本相同。细胞器则具有复杂而多样化的结构，叶绿体和线粒体具有复杂的膜结构，中心粒和毛基体都具有微管或微纤丝结构。

（2）不仅功能不一，而且对于生命活动常是不可缺少的。叶绿体为依靠光合作用生活的生物所必需，线粒体为细胞呼吸所必需，中心粒为细胞分裂所必需。

（3）数目多少不一。每一细胞中有两个中心粒，光合微生物细胞中叶绿体数目不等，同样，线粒体数目在各种微生物中也很不相同。

（4）自体复制。线粒体DNA和叶绿体DNA都可进行半保留复制。除此以外，许多实验和观察结果表明这些细胞器通过分裂产生。

（5）一旦消失以后，后代细胞中不再出现。细胞器中的DNA常呈环状，数量只占染色体DNA的1％以下。与细胞器中的70SrRNA、tRNA和其他功能蛋白形成必要组分，构成一整套蛋白质合成的完全机制。但是细胞器中的许多蛋白不是由细胞器DNA编码的，而是由染色体DNA编码的。

3.微生物中染色体外DNA存在的另一形式———质粒

质粒（plasmid）是微生物染色体外或附加于染色体的携带有某种特异性遗传信息的DNA分子片段，见图6-2b。目前仅发现于原核微生物和真核微生物的酵母菌。

微生物质粒DNA与染色体DNA差别在于：① 宿主细胞染色体DNA相对分子质量明显大于细胞所含质粒DNA相对分子质量，如大肠杆菌（Escherichia coli）染色体的DNA分子碱基数为4.6×103kb左右，而通常用于基因工程中的载体一般均小于10kb，1×106～100× 106Da。② 大肠杆菌染色体质粒DNA较宿主细胞染色体DNA更具耐碱性。③ 质粒所携带的遗传信息量较少。由于质粒DNA的相对分子质量较小，因此所携带的遗传信息远较宿主细胞染色体所携带的遗传信息为小，而且各携带的遗传信息所控制的细胞生命代谢活动很不相同。一般来说，细胞染色体所携带的遗传信息控制其关系到生死存亡的初级代谢及某些次级代谢，而质粒所携带的遗传信息，一般只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞的生死存亡。某些细菌中的质粒还具有以下特性：① 可转移性。即某些质粒可以细胞间的接合作用或其他途径从供体细胞向受体细胞转移。如具有抗青霉素质粒的细胞可以水平地将抗青霉素质粒转移到其他种类细胞中，而使后者获得抗青霉素特性。 ② 可整合性。在某种特定条件下，质粒DNA可以可逆性地整合到宿主细胞染色体上，并可以重新脱离。 ③ 可重组性。不同来源的质粒之间，质粒与宿主细胞染色体之间的基因可以发生重组，形成新的重组质粒，从而使宿主细胞具有新的表现性状。 ④可消除性。经某些理化因素处理如加热或加入丫啶橙或丝裂霉素C、溴化乙锭等，质粒可以被消除，但并不影响宿主细胞的生存与生命活动，只是宿主细胞失去由质粒携带的遗传信息所控制的某些表型性状。质粒也可以原因不明的自行消失。细菌质粒有3种不同的构型，见图6-3。

图6-2 椰毒假单胞菌（Pseudomonascocovenenans）的拟核染色体（a，b）和质粒（b，箭头所指）

细菌质粒和真核微生物细胞器DNA的相同点是：① 都可自体复制；② 一旦消失以后，后代细胞中不再出现；③ 它们的DNA只占染色体DNA的一小部分。不同之处主要是：① 成分和结构简单，一般都是较小的环状DNA分子，并不和其他物质一起构成一些复杂结构；② 它们的功能比自体复制的细胞器更为多样化，但一般并不是必需的，它们的消失并不影响宿主细菌的生存；③ 许多细菌质粒能通过细胞接触而自动地从一个细菌转移到另一个细菌，使两个细菌都成为带有这种质粒的细菌。

图6-3 细菌质粒的3种不同构型

表6-3 大肠杆菌中的染色体DNA和三种常见质粒DNA的形状比较

根据质粒所携带的遗传信息表达后的表型特征可将质粒分类如下：

（1）抗药性质粒（耐药性质粒R因子，resistant plasmid） 携带有分解某种抗生素或药物酶系的基因的质粒，可以赋予宿主细胞耐或抗或分解或失活某种抗生素或药物的性能。某些抗性质粒携带有可以抗重金属如Te6＋，Hg2＋，Ni2＋，Co2＋，Ag＋，Cd2＋，As3＋等毒性的基因。有些质粒还具有对紫外线、X射线具有抗性的基因。多数R因子是由相连的2个DNA片段组成。其一称RTF质粒（resistance transfer factor，抗性转移因子），它含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四环素抗性基因（tet）。RTF的相对分子质量为11× 106Da。其二为抗性决定子（r-determinant），大小很不固定，从几百万直至100×106Da以上。并含有其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素（pen）、安比西林（amp）、氯霉素（cam）、链霉素（str）、卡那霉素（kan）和磺胺（sul）等基因。

R因子在细胞内的拷贝数可从一两个到几十个，分属严紧型和松弛型复制控制。后者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达到两三千个。因为R因子对多种抗生素有抗性，因此可作为筛选时的理想标记，也可用作基因载体。

（2）抗生素产生质粒 携带有合成某种抗生素的酶系基因的质粒，赋予宿主细胞合成某种抗生素的性能。

（3）芳香族化合物降解质粒（degradative plasmid） 携带有分解或降解某种芳香族化合物为简单化合物或无机物的酶系基因的质粒，赋予宿主细胞降解某种芳香族化合物的能力。降解性质粒可在假单胞菌属（Pseudomonas）和其他芳香族化合物降解菌中普遍发现。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）、OCT（辛烷）质粒、XYL（二甲苯）、SAL（水杨酸）质粒、MDL（扁桃酸）、NAP（萘）和TOL（甲苯）质粒等。

（4）大肠杆菌素质粒（Col plasmid，或称Col因子） 携带有产生大肠杆菌素（colicin）酶系基因的质粒，赋予大肠杆菌产生大肠杆菌素的能力。大肠杆菌素（colicin）是一种由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，具有通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能，其相对分子质量约4×104～8×104Da。假单胞菌属和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）分别含有能决定产生绿脓杆菌素（pyocin）和巨杆菌素（megacin）等细菌素（bacte-riocin）的质粒。Col因子可分两类，分别以Col El和Col Ib为代表。前者相对分子质量小，约为5×106Da，无接合作用，是多拷贝的；后者相对分子质量约为80×106Da，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属严紧型控制，只有1～2个拷贝。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。Col El已被广泛研究并应用于重组DNA和体外复制系统上。

（5）性质粒（fertility plasmid）又称F因子 这是第一个从大肠杆菌细胞中被发现的质粒，携带有负责接合转移的基因（tra genes）即编码形成性纤毛的基因和DNA复制的基因。它是E.coli等细菌中决定性别的质粒，是一个相对分子质量为62×106Da、94.5kb、约为2％核染色体DNA的小型cccDNA。它足以为94个中等大小的多肽进行编码，而其中有1／3的基因（tra区）与接合作用（conjugation）有关。F因子除在E.coli等肠道细菌中存在外，还存在于假单胞菌属、嗜血杆菌属（Haemophilus）、奈瑟氏球菌属（Neisseria）和链球菌属（Streptococcus）等细菌中。

（6）限制性核酸内切酶和修饰酶产生的质粒 在这些质粒上携带有编码合成限制性核酸内切酶和修饰酶的基因。

（7）致瘤性质粒（tumor inducing plasmid）

①Ti质粒 Ti质粒是存在于致病菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中的携带有可以导致许多双子叶植物根系产生冠瘿病（crown gall tumor）根癌基因的质粒。当细菌侵入植物细胞后，在其中溶解，把细菌的DNA释放至植物细胞中。这时含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。当前Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性。Ti质粒长200kb，是一大型质粒。

② Sym质粒 Sym质粒是快生型根瘤菌细胞中存在的携带有某种可以识别、侵染相应豆科植物根系与之形成共生根瘤的基因的质粒。

（8）杀伤性质粒 杀伤性质粒发现于真菌的酵母菌（yeast）和黑粉菌的致死颗粒（killer particles）中，其性能如大肠杆菌素质粒。但致死颗粒的基因组都为双链RNA，不是双链DNA，且有蛋白质外壳包围，犹如双链RNA病毒。

（9）已证实和可能与人类疾病有关的质粒 在较少致病性的霍乱弧菌（Vibrio cholera）的菌株中存在有质粒P（性因子，促进接合作用）和V（功能未知），而具有强力致病性的菌株中则没有这样的质粒。质粒P和V被认为其产物可干扰肠毒素的生物合成和膜运输而减少引起霍乱的可能性。致病的产气荚膜梭菌型C（Clostridium perfringens Type C）和引起牙龋的链球菌的突变株都含有质粒，前者的质粒可控制肠毒素的合成，后者的质粒可控制合成不溶性胞外多糖。

（10）酵母菌中的2μm质粒和其他质粒 如存在于真核微生物酵母菌细胞核中但独立于染色体内的长度为2μm并与组蛋白相结合的DNA质粒。酵母菌中还存在其他如编码细菌性纤维素酶的质粒。

4.可在染色体上不同部位之间移动的遗传物质———转座因子等

转座因子包括插入序列（insertion sequences，IS）、转座子（transposons，TN）和某些病毒如Mu噬菌体。这在真核微生物和原核微生物中都有存在。

（1）插入序列 IS能在染色体上和质粒的许多位点上插入并改换位点，因此也称跳跃基因（jumping genes）。

（2）转座子 TN是能够插入染色体或质粒不同位点的一般DNA序列，大小为几个kb，具有转座功能，即可移动至不同位点上去，本身也可复制。转座后在原来位置仍保留1份拷贝。转座子两末端的DNA碱基序列为反向重复序列。转座子上携带有编码某些细菌表型特征的基因，如抗卡那霉素和新霉素的基因，且本身也可自我复制。

另外，侵染微生物的某些DNA病毒、RNA病毒和噬菌体能自我复制，也可整合到染色体或质粒上，且可在微生物细胞之间进行转移而可看作一类微生物染色体外的遗传物质。

5.RNA作为遗传物质

某些动植物病毒和微生物噬菌体是以RNA为遗传物质的。如动物骨髓灰质炎病毒为单链RNA，锡兰豇豆花叶病毒为单链RNA，动物呼肠3型病毒为双链RNA，噬菌体MS2为单链RNA，φ6为双链RNA。这些病毒和噬菌体中没有DNA。Fraenkel-Conrat（1956）利用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）所进行的分析与重建实验证明了杂种病毒的感染和蛋白质的特征是由它的RNA决定的，即遗传物质是RNA。

单链RNA噬菌体MS2很小，长仅26nm，二十面体，每个病毒颗粒由180个壳体蛋白组成。其RNA有3569个核苷酸长，组成的基因可直接感染大肠杆菌。其RNA链可直接作为mRNA起作用，编码成熟蛋白（maturation protein）、壳体蛋白（coat protein）、裂解蛋白（lysis protein）和RNA复制酶（RNA replicase）。

6.关于朊病毒的遗传物质问题

朊病毒（virino）也即蛋白侵染因子（prion，proteinaceous infectious agents），是一种比病毒更小、仅含具有侵染性的疏水蛋白质分子，是一类能引起哺乳动物的亚急性海绵样脑病的病原因子。近年引发世界尤其是欧洲国家恐慌的疯牛病即牛海绵状脑病（spongiform encephalop-athy）、羊瘙痒症（scrapie）等都是由此朊病毒引起的。纯化的感染因子称为朊病毒蛋白（PrP）。在正常的人和动物细胞的DNA中都有编码PrP的基因。且无论受感染与否，宿主细胞中PrPmRNA水平保持稳定，即PrP是细胞组成型基因的表达产物，为一种膜糖蛋白，称为PrPc。PrPc与引发羊瘙痒病的PrPsc是同分异构体，一级结构相同，但折叠程度不同，PrPsc的β折叠程度大为增加而导致溶解度降低，对蛋白酶的抗性增强。

有人认为PrPsc进入细胞后与PrPc结合，形成PrPc-PrPsc复合体，使PrPc构型变化为PrPsc，即形成2个PrPsc分子，2个PrPsc分子再分别与2个PrPc分子结合，进入下一轮循环， PrPsc可呈指数增加。

尽管至今仍有人认为朊病毒含有很少量的核酸物质，但尚无确切证据表明PrPsc的增殖是由核酸控制的。

（三）染色体基因组的编码功能分配与遗传图谱

编码各种功能的基因大多位于微生物染色体上，尤其在原核微生物中。而且编码某类功能的基因在整个染色体基因中的比例在同类微生物中较为相似，不同微生物除个别外也大致相似，见表6-4。

表6-4 染色体上编码各种功能的基因比例（％ ）

注：根据每个种的染色体大小和所含开放阅读框的数量计算。（引自Madigan et al.，2009）

对大肠杆菌基因功能的研究表明，这些基因可以分为不同的功能组。参与翻译、核糖体结构和生物合成的基因166个，参与转录的基因242个，参与DNA复制、重组和修复的基因213个，参与细胞分裂和染色体分离的基因28个，参与翻译后修饰、蛋白转化及具分子伴侣功能的基因119个，参与细胞膜生物合成及编码外膜组成蛋白的基因199个，参与细胞运动及分泌功能的基因115个，参与无机离子转运及代谢的基因169个，参与信号传导的基因140个，参与能量产生及转换的基因267个，参与糖类转运及代谢的基因328个，参与氨基酸转运及代谢的基因340个，参与核苷酸转运及代谢的基因89个，参与辅酶代谢的基因116个，参与脂类代谢的基因85个，参与次生代谢物生物合成、转运及代谢的基因87个。对于各个功能组中的基因，有些已大部分明确了具体功能，有些仅少部分已明确了具体功能。

目前，已经对4000多种微生物的基因组进行了测序，并绘出了它们的染色体基因图谱，如大肠杆菌K12菌株（图6-4）、O-157：H7（EDL933、0509952）菌株，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）IL1403菌株，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）N315菌株等。这些微生物基因图谱的绘制无疑为改造和利用所需的目的基因、构建工程菌提供了极大的方便。

图6-4 大肠杆菌（E.coli）K12菌株的染色体基因图谱

（四）三域微生物遗传物质及其特性的差异

细菌、古菌和真核微生物的遗传物质及其特性存在明显的差异。尽管古菌和细菌都属于原核微生物，但古菌的染色体特性与真核微生物的更为接近。

细菌代表大肠杆菌和其他原核生物中的基因数基本接近，根据其基因组大小所估计的基因数，即这些微生物基因组DNA绝大部分用于编码蛋白质、RNA，用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续而不中断的。大肠杆菌总共有2584个操纵子。73％操纵子中只含有1个基因， 16.6％含2个基因，4.6％含3个基因，6％含有4个或4个以上基因。如此多的操纵子与原核基因的表达大多采用转录调控有关，组成操纵子有极为方便的一面。大肠杆菌中功能相关的RNA基因也串联在一起。如构成核糖核蛋白体的3种RNA基因转录在同一个转录产物16S rRNA-23SrRNA-5SrRNA中，三者比例为1∶1∶1。如它们不在同一转录产物中，则可造成3种RNA比例失调，影响细胞功能，或需要一个极为复杂、耗费巨大的调节机构来保证正常必须的1∶1∶1。大多数情况下，大肠杆菌结构基因在基因组中是单拷贝的，但编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，反映了基因组经济而有效的结构。大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关即按复制方向表达。其中6个分布在DNA的双向复制起点oric（83min处）附近，而不是在复制终点（33min）附近。复制起点处基因表达量几乎是复制终点同样基因的2倍，这有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量的核糖体生成。基因组的重复序列少而短。原核生物基因组有一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，且重复序列短，一般为4～40bp。重复程度有的为10多次，多者达上1000次。

古菌詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）分离自2600m深，2.63×107Pa（260大气压），94℃的海底火山口附近。此菌的基因组全序列分析表明，几乎有一半的基因在现有的细菌和真菌基因数据库中找不到同源序列，只有40％左右的基因与其他二域生物具有同源性，其中有的类似于细菌，有的类似于真核生物，有的就是两者的融合，是细菌和真核生物特征的一种奇异结合体。古菌基因组在结构上类似于细菌。詹氏甲烷球菌环形染色体DNA大小为1.66×106bp，具有1682个编码蛋白质的ORF。功能相关的基因组成操纵子结构，共转录成一个多顺反子；有2个rRNA操纵子；有37个tRNA基因，基本上无内含子；无核膜。但负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物，特别是转录起始系统与真核生物基本相同，而与细菌截然不同。古菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上类同于真核生物的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ ，而不同于细菌的RNA聚合酶。相应的启动子结构也类同于真核生物，TATA-box序列都位于转录起始位点上游25～30核苷酸处，与细菌启动子的典型结构（－10和－35）不一样。古菌的翻译延长因子是EF-Ia和EF-2，而细菌中分别为EF-Tu和EF-G，氨酰tRNA合成酶基因，复制起始因子等均与真核生物相似。古菌另有5个组蛋白基因，其组蛋白的存在可能表明，虽然甲烷球菌基因图谱看来酷似细菌的基因图谱，但基因组本身在细胞内可能实际上是按典型的真核生物方式组成染色体结构。胞内16SrRNA的碱基序列既不同于细菌的16SrRNA碱基序列，也不同于真核生物。古菌具有特殊的与细菌不同而与真核生物相类似的基因转录和翻译系统，此系统不受利福平等抗生素抑制，且RNA聚合酶由多个亚基组成，核糖体30S亚单位的形状、tRNA结构、蛋白质合成的起始氨基酸，对各种抗生素的敏感性等都不同于细菌而类似于真核生物，见表6-5。

表6-5 生命三域的16SrRNA、18SrRNA的特征核苷酸序列

Y：任一嘧啶，R：任一嘌呤，N：任一嘌呤或嘧啶

（引自Madigan et al.，2009）

酵母是单细胞真核生物，已完成全基因组测序，基因组大小为13.5×106bp，分布在16个不连续的染色体中。DNA与4种主要的组蛋白（H2A，H2B，H3和H4）结合成染色质（chro-matin）的14bp核小体核心DNA，染色体DNA上有着丝粒（centromere）和端粒（telomere），没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。最显著的特点是高度重复，如tRNA基因在每个染色体上至少4个，多则30多个，共约有250个拷贝。基因组上有许多较高同源性的DNA重复序列，这是一种进化。即可在少数基因发生突变而失去功能时不会影响生命过程，也可适应复杂多变的环境，丰余的基因可在不同的环境中起用多个功能相同或相似的基因产物，有备无患。酵母菌确实比细菌和病毒进步而富有，而细菌和病毒似乎更聪明，能更经济、更有效地利用遗传资源。