海洋脂肪酶的发酵与酶学性质研究

1.脂肪酶的发酵条件

脂肪酶大多数是胞外酶，易受营养和物理化学因素的影响，如碳源、氮源、诱导剂、无机盐、温度、pH和溶解氧浓度。常见的碳源是玉米油、吐温-80、米糠油、大豆油、葡萄糖、花生油、橄榄油等，氮源如大豆粉、棉籽饼粉、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵等，无机盐常用KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCl2等。一般认为培养基中添加脂类（主要是天然油脂）能诱导合成脂肪酶。对短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus B106）产酶条件的研究表明，与葡萄糖和蔗糖比较，玉米油、大豆油和橄榄油是较好的诱导剂，可使其产生的脂肪酶增加5～6倍。而通过培养基添加不同种类的油对Acinetobacter baylyi 1173320产酶的影响试验表明，该菌株的脂肪酶为组成型，不受油脂类底物的诱导。

几株海洋微生物脂肪酶产生的优化条件见表4-4。

表4-4　海洋微生物脂肪酶的发酵条件参数

2.海洋脂肪酶的酶学性质

中国水产科学研究院黄海水产研究所以海洋微生物通过发酵制备的脂肪酶为材料，对该酶的分离纯化条件及理化性质进行了研究。采用氯仿萃取、中空纤维柱超滤及CMSepharose FF阳离子交换柱层析等技术对发酵制备的脂肪酶进行了纯化，得到电泳纯的脂肪酶。在脂肪酶理化性质研究中，采用SDS-PAGE电泳对该脂肪酶相对分子质量进行测定，并在实验中以橄榄油为底物采用脂肪酶酸碱滴定测活法，对脂肪酶的最适水解条件、多种因素对脂肪酶稳定性的影响进行了研究。结果显示，该脂肪酶相对分子质量为（38.0±1）×103，最适水解温度为35℃，最适pH为8.5，为低温碱性脂肪酶。该脂肪酶可在35℃以下、pH 4～9范围内保持良好的稳定性，与常见金属离子、化学试剂等的配伍性较好，并且具有良好的耐盐及抗氧化性能。研究中还以p-NPL（月桂酸对硝基苯酚酯）为底物采用脂肪酶化学发光测活法，对脂肪酶进行了酶促动力学的研究。结果表明，该脂肪酶在最适条件下Km值为7.805μmol/L，Vmax为1.2385mmol（/L·min）。通过对Zn2＋抑制脂肪酶水解活性的研究，发现Zn2＋对脂肪酶具有可逆抑制作用。

李鹤宾从太平洋深海热液区和厦门近海温泉分离到50株嗜热菌，并进一步对它们的产脂肪酶能力进行了筛选，其中Gebacillus sp.产脂肪酶能力最强。该脂肪酶基因长1254bp，编码417个氨基酸。重组脂肪酶的最适反应温度在40℃左右，在90℃时约有10%的酶活性；最适pH为7～8，在pH 6～9范围内保留80%～100%的活性。该酶在1mmol/L的变性剂（EDTA，2-ME，SDS，PMSF或DTT）和0.1%的去污剂（吐温-20，Chaps或Triton X-100）作用下，EDTA、2-ME、SDS可以抑制18%～30%的重组脂肪酶活性，DTT和PMSF对酶活性基本无影响。0.1%吐温-20、Chaps和Triton X-100对粗酶活性几乎没有什么影响，而对重组脂肪酶的酶活性有5%～10%的抑制。

海洋酵母Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145是从渤海海泥中筛选到的一株能够分泌低温碱性脂肪酶的适冷性海洋酵母菌，该胞外脂肪酶具有的低温、碱性、抗氧化、被表面活性剂激活及生产成本低、产酶周期短等特性使其在洗涤剂行业特别是冷洗行业中具有良好的应用前景。