血清γ－球蛋白的提纯

实验项目十七　血清γ－球蛋白的提纯

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述血清γ－球蛋白提纯的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述血清γ－球蛋白的提纯实验操作要点。

（3）能够准确鉴别血清γ－球蛋白提纯的结果，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成血清γ－球蛋白的提纯的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够正确分析血清γ－球蛋白提纯的结果。

案例引导

肝脏是多种球蛋白合成的场所，测定血清中球蛋白的含量对重性肝炎的病情的严重程度及预后判断都有重要的作用。研究发现，血清中球蛋白含量明显降低者，病情较重且预后较差。另外，血清球蛋白与胆碱酯酶的比值在肝硬化的病情评价及预后判断中有重要的临床价值。请运用所学知识，思考如何提取血清球蛋白。

【实验原理】

1.蛋白质盐析原理

蛋白质分子是生物大分子，其大小恰在胶体的范围，且分子中亲水基团多位于分子表面，疏水基团多位于分子结构内部。所以，在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素，即胶粒上的电荷与水化膜。蛋白质在水溶液中呈两性电离。当环境的pH值与pI值不相等时蛋白质颗粒可带正电荷或负电荷。同性电荷相斥，故使蛋白质不易凝聚沉淀。还由于蛋白质分子带有电荷，故可吸引水分子。破坏这两个或其中任何一个因素，即减弱胶体的稳定性，能使蛋白质易于发生沉淀。

高浓度盐溶液在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，同时还可中和部分电荷，这样就不同程度地去掉了上述两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这个过程称为蛋白质的盐析。

2.脱盐的原理

γ－球蛋白的脱盐——利用凝胶过滤法：凝胶过滤法是当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动速度较慢，最后被洗脱出来。

【实验器材】

离心机，反应机，20cm×1cm层析柱，半透膜，烧杯。

【药品及试剂】

兔血清，磷酸盐，硫酸铵，葡聚糖凝胶，奈氏试剂，碱溶液，稀铜溶液，浓蔗糖液。

【试剂配制】

（1）pH值为7.2的饱和硫酸铵溶液：用浓氨水将饱和硫酸铵溶液的pH值调到7.2。

（2）奈氏试剂：取35g碘化钾和1.3g氯化汞溶解于70mL水中，然后加入30 mL 4mol/L的氢氧化钾溶液，必要时过滤，并保存于密闭的玻璃瓶中。

操作流程

【操作步骤】

（1）盐析：取离心管一支加入血清1mL，加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）稀释血清，摇匀后逐滴加入pH值为7.2的饱和硫酸铵溶液1mL，边加边摇，然后静止放置半小时，离心（转速为3000r/min）20min。将上清液（主要含清蛋白）倒入试管中，留供后面实验使用。

离心管底部的沉淀用1mL PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5mL，摇匀后放置半小时，离心（转速为3000r/min）20min：弃去上清液，其沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白。

（2）层析：称取葡聚糖凝胶G 25.4g，放入100mL烧杯内加入蒸馏水约50mL，用小火煮沸1h，静止冷却后倒去上层蒸馏水，再加入PBS 10mL，将杯内的凝胶用玻璃棒轻轻搅拌使之悬起，倒入有少量玻璃棉堵住下口的20cm×1cm层析柱中，层析柱下口可套一小段橡皮管。当全部凝胶都倒入柱内且液面接近凝胶面时，可分多次加入并用凝胶管夹紧。在柱内凝胶面上平铺一张小圆纸片，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液面已全部刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再扭紧，装柱工作即告完成，此层析柱可供脱盐使用。

在盛有γ－球蛋白沉淀物的离心管内，加入PBS 10滴并用玻璃棒轻轻搅拌，至全部沉淀物溶解后先用滴管吸出γ－球蛋白溶液，然后再将滴管插入凝胶层析柱内，使滴管口靠近凝胶面且缓慢滴入全部蛋白溶液，然后小心松开螺旋夹，使液体流速控制在每分钟5滴左右，待全部蛋白液体流入凝胶柱后，再陆续小心加入PBS 5～10mL。

准备12支干净的试管用于收集凝胶柱流出液，每收集20滴换一支试管，直到全部试管都收集到流出液后，将螺旋夹拧紧，各管留供后面的实验使用。

准备干净的反应板两块。每块反应板各个孔中依次加入用试管收集的液体1滴，然后在其中一块反应板的每个孔内再加入奈氏试剂1滴，记录下各孔的颜色变化。在另一块反应板的每个孔内各加碱溶液1滴及稀铜溶液1滴，观察双缩尿反应的呈色深浅，并用上述符号记录各管的颜色变化。将呈色最浅的孔所对应的管内液体留供聚丙烯酰胺凝胶电泳检查纯度及浓缩实验使用。

（3）透析及浓缩：取玻璃纸一张（15cm×15cm），折成袋形，将前面第一次盐析得到的含清蛋白的上清液倒入袋内，用线绳缚紧上方开口后再用玻璃棒将其悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部浸入蒸馏水中。将杯放在微振荡器上振荡1h以上（中间换水1～2次），然后将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸出袋内液体放入干净试管中，用双缩脲法分别检查袋内、外液体中的蛋白质，再用奈氏试剂检查袋外的液体的。观察透析法除盐的效果。

另取玻璃纸一张，同上法将前面凝胶过滤除盐得到的γ－球蛋白溶液放入透析袋内，悬于盛有10mL浓蔗糖或聚乙二醇溶液的烧杯内，同样振荡1h以上，观察袋内液体体积的变化。小心收集袋内液放入试管内，置于冰箱内保存供以后实验使用。

【实验数据处理及结果分析】

醋酸纤维素薄膜电泳或SDS－PAGE电泳检测所得样品。

【注意事项】

（1）装柱时注意凝胶均一，无气泡，无断层，柱床面平整。

（2）层析时注意控制速度，不要过快。

（3）加样时注意动作轻柔，避免破坏柱床面平整。

（4）层析时柱床面上要保持有液体。

【实验意义】

盐析是分离提纯蛋白质的一种重要方法，在医药行业中有广泛的应用。

能力检测

一、单项选择题

1.盐析法分离蛋白质的原理是（　　）。

A.能破坏蛋白质的一级结构　　　　　　B.能破坏蛋白质的二级结构

C.能破坏蛋白质水化膜而改变溶解度　　D.能使蛋白质发生变性沉淀

E.以上都不是

2.血清总蛋白测定，临床上首选的常规方法是（　　）。

A.酶试剂法　　　　　B.凯氏定氮法　　C.双缩脲法

D.紫外分光光度法　　E.磺柳酸法

3.肝功能障碍除下列哪种蛋白质外，含量均可减少？（　　）

A.清蛋白　　　B.γ－球蛋白　　　C.α－球蛋白

D.凝血酶原　　E.纤维蛋白原