转录起始调控

转录水平的调控是真核生物基因表达调控的最重要环节。在基因内、外都有一些特定的DNA序列，与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合，这些特定的DNA序列称为顺式作用元件（cis-actingelements），亦称为顺式调控元件。真核生物基因的顺式作用元件包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。能够与顺式作用元件特异性结合、对基因表达的转录起始过程有调控作用的蛋白质，称为基因特异性转录因子（gene specific transcription factors），在真核生物中，这些因子又称为反式作用因子（trans-acting elements），它们通常是通过与增强子或上游启动子元件结合而发挥作用，其中一些对基因表达有激活作用的因子又称为激活蛋白（activators）。在基因转录起始阶段，通用转录因子可以协助RNA聚合酶与启动子结合，但其作用很弱，不能高效率地启动转录。只有在反式作用因子（基因特异性转录因子）的协助下，RNA聚合酶Ⅱ和TFⅡ才能有效地形成转录起始复合物。

细胞内的反式作用因子都是处于有活性和无活性两种状态，这两种状态是可以转换的。反式作用因子处于无活性状态时，与之相应的基因就不能表达；反式作用因子处于有活性状态，并且与相应的顺式作用元件结合时，就可以促进RNA聚合酶和通用转录因子与相应的启动子结合，形成转录起始复合物。所以，真核基因的表达调控主要是调节反式作用因子的活性，随后反式作用因子控制基因的转录起始。

（一）真核生物的顺式作用元件

本节主要介绍含Ⅱ类启动子基因的顺式作用元件。Ⅱ类启动子是由RNA聚合酶Ⅱ识别和启动转录的启动子，此类基因的顺式作用元件包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

1．启动子 Ⅱ类启动子通常是由TATA盒与部分上游启动子元件组成（管家基因和同源盒基因不含有TATA盒）。有些Ⅱ类启动子还包括转录起始位点处的保守序列，这些保守序列称为起始子（initiator），起始子含有一致性序列PyPyANT／APyPy，Py是嘧啶（C或T），N代表任意碱基，A是转录起始位点。

TATA盒是Ⅱ类启动子中最主要的成分，位于转录起始点上游-25bp处，TATA盒并不是仅由TATA构成，其核心序列是TATA（A／T）A（A／T）。在不同的基因中序列不完全相同，其一致性序列是：T82A97T93A85（A／T）100A83（A／T）83。TATA盒精确地决定RNA合成的起始位点，其序列的完整性与准确性对维持启动子的功能是必需的，如某些碱基发生突变，甚至A和T的互变都能导致启动子失活。

2．上游启动子元件 上游启动子元件是一些位于TATA盒上游的DNA序列。包括CAAT盒、GC盒、CACA盒、TAGCAAAT序列等。CAAT盒序列特征为5′GGNCAATCT3′，GC盒序列特征为5′CCGCC3′，这两个元件位于-40和-110之间。与GC盒结合的反式作用因子是Sp1。与CAAT盒特异性结合并刺激基因转录的反式作用因子至少有两个：CAAT结合转录因子（CAAT-binding transcription factor，CTF）和CAAT／增强子结合蛋白（CAAT／enhancer binding protein，C／EBP）。

反式作用因子与上游启动子元件结合后可调节基因的转录，主要是调节TATA因子与TATA盒的结合、调节RNA聚合酶与启动子的结合、调节转录起始复合物的形成（转录起始因子与RNA聚合酶结合）增强转录的效率。但上游启动子元件并不是增强子，其位置不能有大的改变，必须在启动子附近。如GC盒只要向上游或下游移动几十个碱基对的距离，就会失去刺激转录的功能。

3．增强子 可被视为最重要的顺式调控元件。它是指能够结合特异基因调控蛋白，增强启动子转录效率的DNA序列。增强子序列长度为100～200bp，核心序列通常由8～15个核苷酸组成，具有回文结构特征。增强子的作用与其所处的位置或方向无关，即在所调控基因的上游或下游均可发挥作用，顺或反的序列均可发挥作用，在基因之外或某些内含子中也可发挥作用。

（1）反式作用因子与增强子结合后的作用机制模式：①改变DNA模板结构，例如影响染色质的DNA-蛋白质的结构，改变DNA超螺旋结构的密度。②提供一个能使DNA模板局限在一个特定空间的微环境。③为RNA聚合酶和其他一些必需的蛋白因子提供一种与染色质相关的联系结构，而这种结构是RNA聚合酶所必需的，增强子通过与RNA聚合酶相互作用而发挥功能。有些增强子能对一个以上的基因发挥作用，如位于鸡β-珠蛋白基因下游和ε-珠蛋白基因上游的增强子，对β-珠蛋白基因和ε-珠蛋白基因都能产生效应。

（2）多重增强子（multiple enhancers）作用：许多基因都具有多个增强子，可以对多种刺激产生反应。例如，金属硫蛋白（metallothionine，MT）是一种富含Cys残基的小分子蛋白，在细胞内能够与重金属离子（如铬）结合，以清除细胞内过量的重金属，保护细胞免受重金属的毒害。MT基因可被不同的因素打开，而平常则以较低水平表达。研究发现，在MT基因转录起始位点上游除了TATA盒、上游启动子元件GC之外，还有多个增强子元件：包括4个金属反应元件（使基因能够对重金属的刺激产生应答）、2个基础水平增强子（basal level enhancer，BLE，与激活蛋白AP1起反应）和1个糖皮质激素反应元件。结合于这些增强子的每一个激活蛋白都能够与组装在启动子上的前起始复合物相互作用，可能是通过其间的DNA成环作用。多重增强子的调控模式也显示出基因表达的精密控制。激活蛋白的不同组合可以使一个特定的基因在不同细胞中以不同水平进行表达。增强子的作用并不是简单的叠加，多重增强子是可以协同作用的。

4．沉默子 沉默子的特点与增强子相似，只是作用效果刚好与增强子相反，它是对启动子起负调控作用的DNA序列。有时，同一DNA序列既可以有增强子的活性又可以有沉默子的活性，这取决于与之结合的蛋白质。如甲状腺激素反应元件（thyroid hormone response element，THRE），当甲状腺激素受体单独与THRE结合时，对基因转录起抑制作用，此时THRE是起沉默子的作用；当甲状腺激素受体与甲状腺激素结合后再与THRE结合时，则对基因转录起促进作用，此时THRE起增强子的作用。

5．反应元件（response elements） 是细胞为了应对各种刺激作出反应而存在于DNA分子上特殊的核苷酸序列。这些特殊的序列存在于某些基因的上游，与增强子、沉默子和启动子一起调节它下游基因的表达。

结合反应元件的反式作用因子是一些信息分子的受体。外来信号刺激后，受体被激活，结合特异的DNA序列，激活基因表达。如糖皮质激素进入细胞后，与其受体结合，使受体活化。活化的受体再与DNA上特定的糖皮质激素反应元件（GRE）结合，调节基因转录。常见的反应元件有激素反应元件（HRE）、热激反应元件（HSE）、金属反应元件（MRE）、血清反应元件（SRE）等多种。反应元件的存在可以使细胞能够协同调节一些在空间上分离的基因的表达。

（二）真核生物的反式作用因子

反式作用因子在细胞中的数量很低，大约每3 000个核小体中有一个分子，或每个哺乳类细胞中104左右。这些蛋白质识别和结合特定的顺式作用元件，促进（正调控）或抑制（负调控）邻近基因的转录。在多细胞有机体中，不同的细胞类型具有不同的反式作用因子群体，引起每一细胞类型表达不同的成套基因。

1．主要特点

（1）一般具有3个功能结构域：DNA结合结构域、转录活性域和结合其他蛋白的结合域。这些功能区含有几十到几百个氨基酸残基。

（2）能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件。

（3）对基因表达有正性和负性调控作用，即激活和阻遏基因的表达。具有正性调节作用的反式因子和相应的顺式元件结合后，通过与RNA聚合酶或其他反式因子与相应的顺式元件结合而产生效应。

2．DNA结合结构域（DNA-binding domain）的模式 DNA结合结构域是反式作用因子识别特异DNA调控元件的结构域。一个反式作用因子的DNA结合域通常具有下列结构中的一种。不同的反式作用因子的DNA结合域即使具有相同的结构特征，其结构（特别是氨基酸序列）也不会完全一致，因而不同的反式作用因子才能识别和结合不同的顺式作用元件。

（1）α螺旋-转角-α螺旋（helix-turn-helix，HTH）结构：HTH由2个短的α螺旋（由20个氨基酸组成）和1个位于两螺旋之间的转角组成，其中一个α螺旋直接与DNA大沟接触，以识别和结合特异性的顺式作用元件。

（2）锌指结构（zinc finger motif）（图5-11）：锌指结构是含有锌离子的DNA结合蛋白模体。根据含Cys和His的不同分为三类锌指结构：C2H2、C4和C6。C2H2锌指结构是由2个反平行的β折叠和一个α螺旋折叠而成，与锌离子配位结合的是2个Cys和2个His，由α螺旋与DNA结合。具有锌指结构的反式作用因子，通常含有不止一个的锌指结构。如转录因子TFⅢA具有9个C2H2锌指结构，TFⅢA依赖9个锌指结构与相应的DNA序列（5SrRNA基因的内调控区域，约45bp）结合，每个锌指结构的指端部分可以进入DNA双螺旋的大沟或小沟。TFⅢA的羧基端部分不具有锌指结构，功能是与RNA聚合酶Ⅲ和其他的转录因子相互作用。

图5-11　锌指结构空间构象

需要注意的是，并不是含有锌指结构的蛋白质就一定能够与DNA结合，如含有锌指结构的PKC就不能与DNA结合。

（3）亮氨酸拉链结构（Leucine-Zipper，LZ）：该结构域中具有一段约由30个氨基酸组成的核心序列，每隔几个氨基酸残基就有规律地出现1个亮氨酸残基，形成两性α-螺旋（amphipathic-helix）。疏水的亮氨酸侧链集中在α螺旋的一侧，亲水残基（如Arg、Gln、Asp等）集中在α螺旋的另一侧。两条α螺旋平行排列，亮氨酸残基侧链之间通过疏水作用像拉链一样紧密交错，结合在一起，形成二聚体，故称为亮氨酸拉链。在其N端富含碱性氨基酸的区域（带正电荷）能与DNA磷酸基团的负电荷结合。

在许多转录因子中存在亮氨酸拉链结构域，例如，C／EBP（CAAT box／Enhancer Binding Protein）的亮氨酸拉链区有4个亮氨酸残基，每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸。C／EBP的二聚体与顺式元件结合后，两个C／EBP的拉链区形成亮氨酸拉链。拉链区附近的肽段具有碱性，含有与DNA的结合点。二聚体的形成可使碱性区形成适当的构象，适合与DNA结合。原癌基因产物Jun和Fos也是通过亮氨酸拉链形成异二聚体（即AP-1）才能有效结合DNA元件（图5-12）。

图5-12　亮氨酸拉链模体的结构

（4）螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）结构：该模体由2段两性α螺旋和之间的环状结构构成，环状结构长度不等。螺旋-环-螺旋结构可介导形成异二聚体和同二聚体。例如：能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的反式因子E12和E47具有这种结构。E12和E47羧基端的100～200个氨基酸肽段具有两个α-螺旋，其间的肽段可形成一个环，附近有一段富含碱性氨基酸的区域。HLH结构介导两个分子结合形成二聚体，从而使两分子中的碱性氨基酸区形成适合与DNA结合的构象。如果一个具有碱性区的分子与一个没有碱性区的分子形成异二聚体，则不能与DNA结合。

3．转录活化结构域（transcriptional activationdomain）的模式 转录活化结构域是反式作用因子与其他蛋白质相互作用的结构域，常见的转录活化结构域有以下几种。

（1）酸性α-螺旋结构域（acidicα-helix domain）：其结构特点是含有较多的负电荷，并能形成亲脂性α-螺旋。在糖皮质激素受体中发现的两个转录活化结构域之一符合酸性α-螺旋模型。

（2）富含谷氨酰胺结构域（glutamine-rich domain）：转录因子Spl与转录活化相关的4个区域，都位于锌指DNA结合区之外，其中两个作用最强的含有约25个谷氨酰胺，而含电荷氨基酸很少。另外，哺乳动物的Oct-1、Oct-2、Jun、Ap-2和CRF中也含有此结构域。

（3）富含脯氨酸结构域（proline-rich domain）：含脯氨酸结构域是在CTF／NF-1中发现的。CTF羧基末端含脯氨酸（20%～30%）的区域与包括Spl锌指结构在内的各种DNA结合结构域相连，可促进转录。

4．反式作用因子的活性调节　大多数反式作用因子本身的活性也是受到调控的，这些反式作用因子在调节其他基因转录前首先自己要被激活，激活的方式有以下几种。

（1）表达式调节：反式作用因子合成出来就具有活性。这一类反式作用因子只是在需要时才合成，并通过蛋白水解迅速降解，不能积累。

（2）共价修饰：①磷酸化-去磷酸化，许多反式作用因子在合成以后可在细胞内持续存在较长时间。大多数是磷蛋白，其功能通过磷酸化、去磷酸化作用进行调节。②糖基化也是反式作用因子活性调节的一种方式。细胞内的许多转录因子都是糖蛋白，其合成后的初级产物是无活性的，经糖基化的修饰就能转变成具有活性的糖蛋白。由于糖基化与磷酸化的位点都是在丝氨酸和苏氨酸残基的羟基上，故两种修饰可能是竞争性互相排斥的。

（3）配体结合：许多激素受体也是反式作用因子，本身对基因转录无调节作用。当激素进入细胞后，受体与激素结合，才能够作为转录因子调节某些基因的表达。

（4）蛋白质与蛋白质相互作用：蛋白质-蛋白质复合物的解离及形成，是许多细胞内活性调节的一种重要的形式。有些反式作用因子与另一蛋白形成复合物后，才具有调节活性。如c-myc蛋白，主要位于细胞核中，可与DNA结合。c-myc蛋白具有螺旋-环-螺旋和碱性亮氨酸拉链结构域。这两种结构都以异二聚体形式起作用，单一的c-myc蛋白结合靶DNA的效率很低，需要与其配对蛋白max构成异二聚体，才能调节基因表达。

5．反式作用因子的作用 增强子通常与其所调控的基因相距较远，上游启动子元件也与RNA聚合酶结合位点有一定距离。反式作用因子与这些元件结合后如何影响到远距离RNA聚合酶结合位点，影响其转录起始的呢？目前提出以下几种作用模式：

（1）扭曲（twisting）：反式作用因子与增强子结合后，可通过扭曲作用使DNA链发生拓扑学变化，DNA的构型发生改变后，更适合于通用转录因子以及RNA聚合酶结合。

（2）滑动（sliding）：作为反式作用因子的蛋白质，先与特定的增强子结合，然后沿DNA滑动，直到接触与另一特异DNA序列结合的转录因子，发挥调节作用。

（3）成环（looping）：反式作用因子结合于增强子后，利用DNA的柔曲性，弯曲成环，使增强子区域与RNA聚合酶结合位点靠近，直接接触而发挥作用。

6．通用转录因子和RNA聚合酶与启动子的结合 这是蛋白质与DNA之间的相互作用。这种作用的特异性取决于蛋白质和DNA之间是否具有能够结合的基团，蛋白质和DNA的空间构象是否能使这些基团有效接触以形成氢键和疏水键等配位键。

由于不同基因中启动子的序列有差异，通用转录因子和RNA聚合酶与启动子之间的空间构象并不完全契合，难以有效结合。或者即使能够结合，也难以打开DNA双链形成开放的起始复合物。而反式作用因子一旦激活后，与相应的顺式作用元件可以特异性结合，随后可以通过与DNA的相互作用或者与通用转录因子之间的相互作用使其构象发生适当的改变，从而使通用转录因子和启动子DNA序列的构象完全契合，促进转录因子与启动子的结合；或者辅助RNA聚合酶和通用转录因子打开DNA双链，形成开放的起始复合物，起始转录。

有些反式作用因子的作用是改变DNA构象，这些因子亦称为建筑性转录因子（architectural transcription factors）。有些增强子与启动子元件的距离很近，因此，激活蛋白和通用转录因子结合到DNA上以后，相距很近，其间的DNA片段很短，较短的DNA刚性较强，不易弯曲，在这种情况下，建筑性转录因子可以发挥辅助作用，这类转录因子唯一（或主要）的作用是改变调控区的DNA片段的形状，以使蛋白质便于相互作用，刺激转录起始。如人T细胞受体α-链基因的调控区，有3个增强子，分别为激活蛋白Ets-1、LEF-1和CREB的结合位点，与转录起始位点的距离均在112bp之内，LEF-1是淋巴样增强子的结合因子，与相应增强子结合后，可以辅助激活TCRα基因。该因子单独作用时不能激活TCRα基因的表达，其作用是结合到增强子处DNA的小沟，使DNA弯曲130°，从而使其他反式作用因子与通用转录因子之间可以相互作用。

7．人干扰素-β基因的表达调控 需要上述辅助因子的作用。如图5-13所示，ATF-2（activation transcription factor 2）是一个激活蛋白，与C-Jun形成一个二聚体，结合于DNA，与两个HMG I（Y）分子同时结合于增强子；前者结合于DNA的大沟，后者结合于DNA的小沟；IRF亦是激活蛋白，NF-κB（p50和p65）是免疫系统基因的激活蛋白，与一分子的HMGI（Y）同时结合于DNA，亦是前者结合于DNA大沟，后者结合于DNA小沟。HMG I（Y）不能单独作为反式作用因子激活基因转录，它是其他两个反式作用因子（ATF-2和NF-κB）与相应的增强子结合所必需的。HMG I（Y）的作用是改变增强子DNA的构型，使反式作用因子能够相互接触，形成增强子小体（enhanceosome），并能与通用转录因子和RNA聚合酶相互作用，促进起始转录。

图5-13　人干扰素-β基因增强子

NF-κB可被多种信号激活，亦可激活多种细胞因子基因的表达。然而只有在病毒感染时，刺激产生HMG I（Y），NF-κB才能激活IFN-β基因的表达。没有病毒感染时，没有HMG I（Y）产生，不能在IFN-β基因的调控区形成增强子小体，因此，即使其他刺激信号可以激活NF-κB，也不能激活IFN-β基因转录。

（三）中介因子在基因转录起始调控中的作用

有些反式作用因子并不能直接作用于通用转录因子或DNA，而是通过中介因子（mediator）的作用控制基因转录的起始。

在真核生物中，cAMP可以激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），激活的PKA进入细胞核，使cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）磷酸化。CREB磷酸化以后，CREB结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）才能与之结合。与CREB结合后的CBP能够作用于通用转录因子（包括TFⅡB），促进TFⅡB等通用转录因子与启动子结合。CBP将CREB与转录装置偶联起来，在转录激活中起着共激活因子（coactivator）或中介因子的作用（图5-14）。CBP的中介因子作用并不局限于cAMP反应基因。它在基因对核受体的反应中亦发挥中介因子的作用。许多核受体与通用转录因子之间并不能直接相互作用，CBP（或其同源物，如P300）是作为中介因子在核受体与基础转录装置（basal transcription apparatus，即通用转录因子与RNA聚合酶组成的前转录起始复合物）之间发挥作用。CBP可以两种方式发挥这种作用，第一，它直接与核受体的激活结构域相互作用；第二，CBP结合于称为类固醇受体激活因子（steroid receptor coactivators，SRCs）的蛋白，这些蛋白与核受体相互作用，而CBP接触基础转录装置。这两种方式的任何一种都会促进基础转录装置结合到启动子，并激活转录。

图5-14　CRE偶联基因的激活模式

综上所述，每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因表达的调控不是由单一因子完成的，而是几种因子组合，发挥特定的作用，称为组合式基因调控（combinatorial gene regulation）。每一调节蛋白单独作用，对转录所产生的影响可以是正调控，也可以是负调控，不同因子综合，决定一个基因的转录。实际上，净效应不是简单加和的结果，在某些情况下，两个调控蛋白结合到DNA上后，可以相互作用改变各自的活性。通常是几种不同的反式作用因子控制一个基因的表达，而一种反式作用因子也可以参与调控不同的基因表达调控。反式作用因子的数量是有限的，这种组合式作用方式使有限的反式作用因子可以调控不同基因的表达。如图5-15所示，基因A的调控区结合了反式作用因子A、B、C，基因B的调控区结合了反式作用因子A、B、D。ABC组合使基因A转录，ABD组合则可抑制基因B转录。

图5-15　结合于上游启动子元件和增强子元件的反式作用因子组合式调控模式