实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
【教学目标】
（1）简述血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳的原理。
（2）阐述醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带。
（3）阐述血清蛋白电泳分析的临床意义。
（4）掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作。
【实验原理】
带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。血清中各种蛋白质都是两性电解质，其等电点大多在pH 7．0以下，若将血清置于pH 8．6的缓冲液中，则这些蛋白质均带负电荷，在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH值环境中所带电荷多少、分子大小和形状不同，在电场中泳动速度也不同，因此，醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白质分成五条区带。
醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物，具有微量、快速、简便及分辨率高等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。
【试剂】
（1）巴比妥缓冲液（pH 8．6，离子强度0．06）：称取巴比妥2．21g、巴比妥钠12．36 g并加入500mL蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，加蒸馏水至1L。
（2）染色液：称取氨基黑10B0．5g，溶解于甲醇50mL中，加入蒸馏水40mL、冰醋酸10mL，混匀。
（3）漂洗液：取95%乙醇45mL、冰醋酸5mL、蒸馏水50mL，混匀备用。
（4）0．4mmol/L NaOH溶液。
（5）透明液：取冰醋酸25mL和无水乙醇75mL，混匀备用。
【器材】
醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、水平醋酸纤维膜电泳仪（实验图1－1）、电泳槽、分光光度计。
实验图1－1 水平醋酸纤维膜电泳仪
注：1，4—滤纸桥；2—醋酸纤维素薄膜；3—电极桥支架。
【操作】
（1）电泳槽准备：向两侧电泳槽内加注等量缓冲液，使两槽内液面在同一水平状态，液面距支架上端约2cm。用三层滤纸或双层纱布搭成盐桥。
（2）薄膜准备：取薄膜，先在薄膜无光泽面一端约2．0cm处用铅笔划一直线，表示点样位置，并编号标记。将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中，待充分浸透后（约20min）用竹镊子取出，用滤纸轻轻吸去多余的缓冲液。
（3）点样：取少量血清置于普通玻璃板上，用点样器（血红蛋白吸管或盖玻片均可）的钢口蘸取血清，然后将钢口平直“印”于点样线，待血清渗入膜后移开点样器。注意，应使血清均匀分布在点样区，切不可因用力过大、过猛而弄破薄膜。点样是获得清晰电泳图谱的重要环节。
（4）电泳：将已点样的薄膜端靠近阴极，无光泽面向下（以防蒸干）平整地紧贴在电泳槽支架“滤纸桥”上。支架上事先放置好两端浸入缓冲液的用四层滤纸条做的“滤纸桥”，平衡5min后通电。一般电压为120～150V，电流为0．4～0．6mA/cm，通电40～50min，待电泳区带展开3．5～4cm时关闭电源。
（5）染色：用竹镊子小心取出薄膜直接浸于染色液中，5min后取出，漂洗液连续浸洗数次，即可见五条蛋白质区带。从阳极端起依次为清蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白和γ－球蛋白。
（6）定量：取试管六支，依次编号为空白、清蛋白、α1－球蛋白、α2－球蛋白、β－球蛋白和γ－球蛋白，将漂净的薄膜用滤纸吸干，蛋白质区带分段剪下，放入相对应的试管中，在薄膜两端剪取与α1－球蛋白相同大小的空白膜条放入空白管。清蛋白管内加入0．4 mmol/L NaOH溶液6mL，其余各管依次加0．4mmol/L NaOH溶液3mL，振摇数次，使染色浸出，约25min后，用分光光度计于620nm波长处比色，空白管调零，读取各管吸光度，按下式计算各部分蛋白质所占百分比（相对百分含量）。
（7）如需保存电泳结果，可使薄膜透明化，方法如下。将染色、漂洗、干燥后的醋酸纤维薄膜电泳图谱置于透明液中浸泡3min，然后取出，贴于玻璃板上，不要存留气泡。经2～3min后薄膜便完全透明，待干后撕下压平，可长期保存。
【临床意义】
（1）正常参考范围如下。清蛋白所占百分比：57%～72%。α1－球蛋白所占百分比：2%～5%。α2－球蛋白所占百分比：4%～9%。β－球蛋白所占百分比：6．5%～12%。γ－球蛋白所占百分比：12%～20%。
（2）肝硬化时清蛋白显著减少，α1－球蛋白、α2－球蛋白轻度减少，β－球蛋白和γ－球蛋白增加，出现β－球蛋白和γ－球蛋白难以分离的β－γ桥。
（3）当患有肾病综合征时，清蛋白明显降低，α1－球蛋白、β－球蛋白轻度增加，α2－球蛋白显著增加，γ－球蛋白轻度减少。
（4）当患有多发性骨髓瘤时，β－球蛋白轻度增加，γ－球蛋白显著增加。
（5）妊娠时清蛋白、γ－球蛋白轻度减少，β－球蛋白轻度增加。
（6）当患有无丙种球蛋白血症时，γ－球蛋白显著减少（少见）。
【注意事项】
（1）通电后不得接触槽内物品，以防触电。
（2）缓冲液不宜长期使用，定期更换（用过10次后）。
（3）电泳槽内缓冲液的液面要保持一定高度且相同，否则会产生虹吸现象，影响电泳速度。
（4）点样要均匀，不宜过多，以3μL为限。
【思考题】
（1）血清蛋白质电泳分析有何临床意义？
（2）一种蛋白质的等电点为pH 4．9，而另一种蛋白质的等电点为pH 9．6，它们在pH 8．6的缓冲液中应带什么电荷？在电场中的电泳方向如何？
（仲其军）
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