营养学实验设计原则与基本方法

4．1　营养学实验设计原则与基本方法

科学研究的发展历程，是从单纯表面现象的观察，进而深入到实验研究。营养实验研究，就是在人为控制的条件下，向研究对象施加某种或某些因素的处理，根据实验结果来分析阐明某个营养问题或检验某种假说。在营养科学试验中，为了获取有价值的信息，必须遵循基本的科学研究规范，同时，为了消除各种因素对实验结果的干扰，提高实验的效率，也需要采用一定的控制方法。简而言之，只有科学的实验设计，才能得到科学的实验结果。

实验设计是决定研究工作成败的重要环节之一。一个复杂的实验，如果设计合理，就可以用较少的人力物力和时间，最大限度地获取丰富而可靠的资料。因此，掌握实验设计的基本原则和正确方法，对开展营养科学的研究工作，具有重要意义。

所谓营养实验设计，是指在开展营养研究工作之前，对整个实验研究课题的设计，包括实验目的的确定，实验对象的选择，实验方案的拟订，以及相应资料的收集整理和统计方法的确定等。

4．1．1　营养学实验设计的任务和要求

营养科学是一门以实验为基础的科学，营养学的基本概念和原理都是从对实验对象的观察中总结概括得来的，同样，一些新的想法和假说也需要通过实验得以验证。为了使实验具有良好的科学价值，实验设计必须满足以下几点要求：

（1）代表性

代表性是指实验条件能够代表将来准备采用这种实验结果的实际条件，在确定实验条件时，应该用发展的眼光，既要能代表目前的条件，还应该兼顾将来可能发展变化的条件，使实验结果既能符合当前的需要，又具有一定的前瞻性。

在实验研究中，由于无法对所有的实验对象进行研究，因而只能采用抽样的方法，抽取一定数量具有代表性的个体作为样本，用以代表实验对象的总体。在此过程中，应该严格遵循统计学中随机抽样的原则，同时，样本的数量也应该满足代表性的要求。

（2）正确性

正确性包括两个方面，即实验的准确性和精确性。准确性是指在实验中实验的结果是否接近于真值。精确性则是指实验的误差要尽可能小。只有兼具准确性和精确性的实验结果才具有较高的科学价值和应用价值。

（3）重演性

重演性是指在一定条件下进行相同的实验时，能够获得类似的结果，这是检验实验科学性的一条重要原则。结果无法重演的实验，说明实验的代表性和正确性存在疑问。为了保证实验的重演性，必须充分考虑实验的各种影响因素，严格控制实验中的各个环节。实验的重演性与实验的正确性和代表性密切相关。

4．1．2　营养学实验的种类

根据实验目的和手段的不同，营养学实验通常可以分为以下几个方面：调查性实验、化学分析性实验、动物和人体实验、分子生物学实验。

（1）调查性实验

主要通过调查的方法，了解个体和人群的膳食状况，评价人群的营养状态，测算人群的营养需要量，了解膳食模式与健康的关系等。

（2）化学分析性实验

主要通过各种化学分析手段和方法，了解食物中的营养素和功能性成分的含量、分布以及变化规律，确定食物中的营养和功能性成分的结构和功能等。

（3）动物和人体实验

主要通过动物和人体实验，了解食物中营养素和功能性成分在体内的代谢变化，营养素和功能性成分的营养和保健功能，营养缺乏和营养过剩的生物反应，营养干预的效应等。

（4）分子生物学实验

应用分子生物学的技术手段，了解食物中的营养素和功能性成分作用的分子机制，营养相关性疾病的发生机制等。

4．1．3　营养学实验设计中的基本概念

（1）实验指标

衡量实验结果的标准称为实验指标，例如，在蛋白质营养价值评定实验研究中，可以选取蛋白质的消化率、生物价、功效比、氨基酸分等作为实验指标。在不同的实验研究中，实验指标的选择应该结合实验的目的来确定。实验指标选择合理与否，将直接影响实验结果的科学价值。

（2）实验因子

影响实验指标的条件称为实验因素或实验因子，例如，影响蛋白质营养价值的因素很多，蛋白质的种类、氨基酸模式和加工方法等因素都可能对实验指标产生影响，在实验中，这三种因素都可以作为实验因子。

（3）水平

在每个实验因子中，从质的方面或量的方面分成不同的等级，称之为水平。例如，在以蛋白质的消化率为实验指标的实验中，如果以蛋白质种类作为实验因子，可以选择3种不同的蛋白质（A₁、A₂、A₃），研究其各自的消化率，那么，A₁、A₂、A₃即为从质的方面分的3个水平；如果以蛋白质含量作为实验因子，可以研究同一种蛋白质的3种不同的含量梯度（B₁、B₂、B₃）的消化率，则B₁、B₂、B₃是从量的方面分的三种水平。

（4）处理

某实验因子的若干水平和另一个实验因子的若干水平相互形成的多个实验组合称为处理或水平组合。在只有一个实验因子的单因子实验中，水平和处理是一致的。在有多个实验因子的多因子多水平实验中，可形成多个水平组合，即多个处理。仍然以蛋白质消化率实验为例，如果同时研究蛋白质种类（实验因子1）和蛋白质含量（实验因子2）对蛋白质消化率（实验指标）的影响，可以选择3种不同的蛋白质（A₁、A₂、A₃），每种蛋白质设置3种不同的含量梯度（B₁、B₂、B₃），通过组合后可以得到3×3＝9种水平组合，即9个处理。

4．1．4　营养学实验设计的基本原则

实验设计经常会受到除处理条件以外的其他许多外来因素的干扰，从而产生实验误差，影响实验的准确性和精确性。实验中发生的误差可分为系统误差和偶然误差，前者影响实验的准确性，比较容易控制，后者影响实验的精确性，即使严格控制亦难以完全消除。实验设计的目的，主要是估计实验处理效应和控制实验误差，以便合理地进行统计分析，作出正确的推断。为了降低实验误差，必须了解实验受哪些非处理因素影响，进而从实验设计上加以消除。英国学者费雪提出的3个基本原则———重复、随机化和局部控制，是实验设计必须遵守的规范。

（1）重复

所谓重复，是指接受实验处理的个体在2个以上。实验中设置重复的目的，是为了估计实验误差，提高实验精度，增强实验的代表性。如果在实验中，接受实验处理的个体或对象只有一个，将无法估计实验误差和进行统计检验，也就无法判断和区分实验各处理间的结果差异是反映了处理效应，还是实验误差所致。

实验中重复设置的多少，需要视具体的实验条件和要求，以及实验动物或对象的个体差异来确定，尽力做到既能充分体现处理效应，又不至于使实验规模过大而难以实施。一般而言，在营养实验设计中，根据实验动物个体大小的不同，重复数通常以设置为12～20为宜。

（2）随机化

所谓随机化，是指实验中的每一个实验动物或对象，都有相等的机会接受实验中设置的所有处理。随机化的目的是为了消除人为的主观意图对实验结果的影响，保证实验结果的可靠性。在实验对象的分组过程中，每一组接受处理的安排中，都应该遵循随机化的原则。常用的随机方法有抽签法、抓阄法，但最正规的方法是使用随机数字表法（请参考生物统计的相关书籍）。

（3）局部控制

理论上，理想的实验条件是，对于所有的实验对象，除了实验处理以外，其他的条件完全一致。但上述条件在实际中不可能完全达到。为了保证实验结果的可靠性，在实验设计中，应该采取各种技术措施，尽可能控制和降低非处理因素对实验的影响。局部控制应该贯穿在实验进行的全过程中。在实验中，通常要求实验动物尽量一致，实验处理条件尽量一致，干扰因素控制尽量一致。

4．1．5　营养学实验设计的步骤和常用方法

（1）实验计划的拟定

在实验前拟定出全面合理的实验计划，可以保证实验任务的顺利完成，一般而言，实验计划通常包括以下几个项目：

实验名称或实验题目。

实验目的与意义。

实验方案与依据。

实验动物的选择。

实验设计的方法。

实验记录的项目。

结果的统计分析。

实验条件、设备和经费。

实验时间、地点和人员配备。

预期成果。

（2）实验方案的拟订

实验方案的拟订，是全部实验工作中对实验成败影响最关键的环节，如果考虑不周，可能会由于设计缺陷，导致实验结果杂乱无章，难以分析。或者是由于求全责备，使得实验规模过于庞大，难以实施。拟定一个切实可行的实验方案，应该注意以下几个方面：

①大处着眼，小处着手

在进行实验方案的设计时，应该全面的考虑影响实验结果的各种因素，抓住影响实验结果的主要矛盾。在具体实验方案的拟订时，应该首先考虑实验规模的大小是否具有可行性，在此基础上，尽可能应用简单的实验方案，必须采用复杂方案时，也应该尽量简略，抓住主要因素，使实验研究能够顺利开展和完成。大而全的实验方案，虽然理论上能够得到更加丰富的数据，但也有可能在实施的过程中遇到困难而被迫中止或修改，造成资源的浪费，因此应尽力避免。

②增设预备实验，及时发现问题

实践是检验实验方案合理性的最好途径，由于实验方案的设计中不可避免地会忽略一些问题，因此，通过增设预备实验，能够及时发现这些问题，以便在正式实验中及时予以调整。此外，预备实验还能够使实验动物习惯实验的环境条件，让实验人员熟悉实验操作规程，验证实验设计是否切实可行。一般而言，预备实验期的长短视实验要求而定，通常为15～20天。另外，预备实验的实验动物数量应多于正式实验所需。

③合理设置对照，控制实验条件

设置对照是实验的基本要求，实验处理的效果，只有通过与对照相比较才能显现出来。在对照组的设置中，与实验组相比较，除了实验处理条件不同，其他条件都应该完全一致。设置对照的方法很多，有同一实验组中实验前和实验后的自身对照，有各处理组与一个对照组的比较，也有各处理组相互比较对照。总之，合理设置对照，控制各组之间条件保持一致，是实验成功的重要保证。

④合理设置因子水平，控制实验规模

实验处理的数目决定了实验规模，为了使实验能够顺利开展和实施，应该根据实验目的确定合理的实验因子数目，控制实验的规模在可实施的范围内。同时为了使实验处理间的效应能够充分体现，应该尤为注意合理设置各因子的水平数目和梯度间隔。在实验设计中，一方面，要防止由于水平设置过少或梯度间隔过大而漏掉好的信息，另一方面，也要避免水平过多或梯度间隔过小而陡然增加实验的工作量。对于一个因子的水平数目，通常最少需要设置3个等距水平梯度以利于分析。

（3）实验对象的选择

营养实验的最终目的，是通过对各种动物和人的实验研究，发现或推断人体的营养规律。理论上，人是最合适的实验动物，但是，以人作为实验动物存在着伦理上和实际操作上的巨大限制，因此，大多数的营养研究是用与人代谢规律相近的实验动物作为研究对象，并将实验结果外推于人。尽管这种方法仍然存在着一定的局限性，如果在实验动物的选择上遵循一定的规范，实验结论依然具有一定的科学性和参考价值。在营养实验中，通常可选用大鼠、犬和猪等与人体消化代谢相似的动物作为替代模型。一般要求选用发育正常的青壮年实验动物，体重尽可能一致，性别如无特殊要求通常是雌雄各半，每组动物数目大鼠要求10～20只，犬和猪3～12头。

按照遗传学分类，实验动物分为近交系动物、封闭群动物、突变群动物和系统杂交动物。一般情况下，选择近交系动物的实验重复性较封闭群好。需要强调的是，在实验动物的选择和使用上，还应该遵循国际上通行的3R原则，即Reduction，Refinement，Replacement，尽可能减少实验动物的数量，尽量减少实验动物的痛苦，如有可能，以模型替代动物的使用。

（4）实验设计方法的选择

选择合理的实验设计方法，能够在不增大实验规模的前提下，获取更多的实验信息，充分显现实验处理的效应。在营养研究中，常用的实验设计方法有：完全随机设计、随机区组设计、拉丁方设计和正交设计。

①完全随机设计

完全随机设计是指每个实验单位都有同样的机会分入任何一组，每一组中各实验单位接受各种实验处理的机会均等。这种设计方法能使影响实验结果的其他因素在各组的影响都基本相同。完全随机设计的实质是随机分组的问题。采用随机方法分组完成后，对于每一组接受何种处理，也应采用随机方法安排。

完全随机设计实验的统计方法，依据分组数目的不同，分析方法也各异。如果实验仅分为两组，可采用t检验法。如果实验分为3组或3组以上，可用单因子方差分析法进行F检验（请参考生物统计的相关书籍）。

②随机区组设计

当实验处理数在两个以上时，为了降低实验误差，可以将实验动物组成若干个重复区组，区组内的实验动物大小体重相近，并且动物的数目等于实验的处理数。在实验中，每一区组内的每一个实验动物随机接受不同的处理安排。这种实验设计方法即为随机区组设计。

随机区组设计中，区组重复数的设置与实验动物的个体差异、处理数以及实验精度的要求有关。一般而言，区组的重复数以3～7为宜。

随机区组设计的分析是把区组也看作一个因素，与实验因子一起组成2因子实验，可用2因子单独观察值的方差分析法进行分析（请参考生物统计的相关书籍）。

③拉丁方设计

拉丁方设计可以看作是一种处理数和重复数相同的特殊形式随机区组设计。拉丁方实验的最大优点是采用较少的实验动物在一次实验中可以分析多个因子。所谓拉丁方，是指将实验单位组合排列成直行数、横行数完全相等的正方形。在拉丁方设计中，每一直行及每一横行都成为一完全区组或重复，而每一处理在每一直行或横行都只出现一次。在拉丁方设计中，每一处理在各直行或横行区组的排列必须是随机的。

拉丁方设计可以看成是一种多因子多水平的部分实验，比随机区组设计多了一项变异，分析结果时，除了计算横行和直行因子的变异外，还要将各实验处理引起的变异单独进行计算。因此，拉丁方设计既能剔除直行产生的系统误差，又能够剔除横行所产生的系统误差，是一种精确度较高的实验设计。在标准拉丁方的基础上，如果将每一个实验单位再设置重复，则可以构成精度更高的重复拉丁方。

④正交设计

正交设计是以正交表为实验工具研究多实验因素的一种设计方法。适用于多因素、多水平、实验误差大、实验周期长的实验。正交实验设计的特点是利用一套规格化的表格———正交表来安排实验。应用正交表安排多因素实验的长处在于，可以通过部分实验，了解全面实验的情况和内在规律，用较小的实验规模，较快地找到最优的因子和水平组合。它是生命科学领域广泛应用的实验设计方法。

在进行正交实验设计时，首先，应该根据实验目定确定合理的实验因子和水平数，然后，根据因子和水平数选用正交表，正交表的选择原则是在保证实验精确度的要求的前提下，既要能够安排下实验的全部因子，又要使实验的水平组合号数尽可能少。最后，作表头设计，列出实验方案。

正交实验的结果分析，包括直观分析和方差分析两种，直观分析是通过直接的数据比较和简单的计算，进行实验结果的直观判断。在一般的实验中，通过直观分析基本能够进行实验因子水平的优选。如果为了分辨实验误差，测定各因子水平的变化对实验结果的真正影响，还需要用方差分析的方法作进一步的分析。

（5）实验结果的记录和总结分析

在实验中，各项记录需要以专用记录本，根据实验的计划清晰有条理地登记，形成原始记录。原始记录应该妥善保存，重要的数据要备份保存。在原始数据的记录过程中，要避免抄写错误或遗漏，记录之后还应该认真核对。对实验记录中出现的特异值应追查原因，如果无法找出原因，可按照平均值的2个标准差为界限，超出此界限的特异值允许丢弃。因为这一类数据很可能是不明原因所导致产生的错误数据，并没有代表实验的效应。

在对实验数据进行整理后，经过统计分析后，才能得出实验结论。需要注意的是，统计分析的结果，需要研究人员经过专业思考加以判断。如果实验设计本身存在缺陷，或者原始实验数据存在问题，单凭统计分析而不通过专业判断，有可能得出错误的结论。对于实验中出现的不能肯定的实验结果，应该通过重复实验加以确认。

总之，一项成功的营养实验，始于严谨科学的方案设计，成于严格认真的过程控制，终于严密客观的结果分析。