钩端螺旋体血清学检查方法

二、钩端螺旋体

钩端螺旋体属种类较多，包括问号状钩端螺旋体和双曲钩端螺旋体。前者有致病性，后者无致病性。致病性的钩端螺旋体能引起人畜共患的钩端螺旋体病，简称钩体病。

(一)临床意义

钩端螺旋体病为人畜共患的传染病。目前已从80余种动物体内检出，其中以鼠类与猪为主要传染源和储存宿主，其带菌率高且排菌期长。动物感染后，大多为隐性或慢性感染，钩体在其肾小管中长期生长繁殖，并不断随尿排出体外，进而污染周围的水源与土壤，人类因接触这些污染物而感染。孕妇感染钩体后，也可经胎盘感染胎儿引起流产。偶有由吸血昆虫叮咬而感染者。

致病性钩体有较强的侵袭力，能通过健康或破损的皮肤及黏膜侵入机体，也可由被污染的水与食品经口感染。钩体经皮肤黏膜侵入人体后，在局部迅速繁殖，并入血引起菌血症或败血症，继而扩散至肝、肾、肺、脑及肌肉等组织器官。钩端螺旋体产生具有溶血素和内毒素样物质等致病物质，导致患者出现全身中毒症状，表现高热、乏力、头痛、全身酸痛、结膜充血、腓肠肌剧痛，淋巴结肿大等症状。由于感染钩体型别、毒力和数目的差异，机体免疫症状的不同，临床表现相差甚大。临床常见的有黄疸出血型、流感伤寒型、肺出血型、脑膜脑炎型、肾功能衰竭型等。

隐性感染或病后可获得对同型钩体较持久的免疫力，以体液免疫为主。病后1～2周血清中出现的特异性抗体，具有凝集溶解钩体及调理吞噬作用，迅速清除血液中的钩体。但此免疫对肾脏内的钩体作用不大，故尿中排出钩体达数周、数月甚至数年之久。此外，对异型钩体的感染仅有部分免疫或无免疫力，故有再感染的可能性。

(二)生物学性状

1．形态结构与染色大小约0．1～0．2μm×6～12μm。螺旋细密而规则，菌体一端或两端弯曲呈钩状，整个菌体呈C、S形状(图23－2)。呈旋转或扭转伸屈运动。常用Fontana银染色法，将其染成棕褐色。

图23－2　钩端螺旋体示意

2．培养特性　需氧或微需氧，常用柯索夫(Korthof)培养基(含10%兔血清或牛血清、磷酸盐缓冲液蛋白胨，pH值7．4)培养，最适温度为28～30℃，接种3～4 d后开始生长，1～2周后液体培养基呈半透明云雾状生长;在固体培养基中，可形成透明、不规则的细小菌落。

3．抵抗力　对理化因素的抵抗力较其他致病性螺旋体强。在水或湿土中可存活数月，该特性在钩体病的传播上有重要意义。对热敏感，56℃10 min死亡。对多种化学消毒剂敏感，如石炭酸、来苏儿、漂白粉及盐酸在短时间内均能杀死钩体。对青霉素、金霉素等抗生素敏感。

4．抗原构造　与分类致病性钩体有表面抗原和内部抗原两种。表面抗原存在于螺旋体的表面，为蛋白质多糖的复合物，具有型特异性，为钩体分型的依据。内部抗原存在于螺旋体的内部，是类脂多糖的复合物，具有属的特异性，是钩体分群的依据。目前世界上问号状钩端螺旋体已发现25个血清群和200多个血清型。我国至少存在有约19个血清群、74个血清型。

(三)微生物学检验

1．标本采集　临床标本采集物包括血液、尿液和脑脊液。应在发病1周内取血液，第2周取尿，有脑膜刺激症状者取脑脊液，其检出率较高。

2．检查方法

(1)直接镜检:将标本用低速离心集菌后作暗视野镜检或用Fontana镀银染色镜检，也可用直接免疫荧光法或免疫酶染色法检查。

(2)分离培养与鉴定:将标本接种在Korthof培养基中，28℃培养2～4周，如有生长则培养基变混浊，再用暗视野显微镜检查钩体是否存在，如有钩体再用血清学方法　鉴定其群型。

(3)动物接种:是分离钩体的敏感方法　，尤其适用于有杂菌污染的标本。方法　是将标本接种于幼龄豚鼠和金黄地鼠腹腔。接种3～5 d后，用暗视野查腹腔液;可取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见肺部和皮下有出血斑，肝、脾等脏器中有大量钩端螺旋体存在。

(4)检测核酸方法　:用同位素或生物素标记DNA探针进行核酸杂交及PCR方法　均可检测标本中钩端螺旋体的核酸进行诊断，其特异性、敏感性均优于培养法，且耗时短。

(5)血清学诊断:取发病初期、晚期病人的双份血清，一般在发病初和第3～4周各采集一次。常用显微镜凝集试验检测特异性抗体。该试验用活的标准株或活的当地常见菌株作为抗原，与病人的血清在37℃作用2 h，而后用暗视野显微镜检查。若待检血清中有同型抗体的存在，则可见钩体被凝集成团，形如小蜘蛛样。血清凝集效价在1∶400以上或双份血清效价增长4倍以上者有辅助诊断的价值。其他还有补体结合试验、间接凝集试验、ELISA。