第五章 分枝杆菌细胞壁结构和生物合成
分枝杆菌属的细菌壁与其他原核生物细胞壁有所不同，在系统发育上与革兰阳性细菌密切相关，无革兰阴性菌所特有的典型的脂多糖，但是也有一些与革兰阴性菌细胞壁相似之处，即也有少量的肽聚糖（peptidoglycan）、中位－二氨基庚二酸（DAP）和类脂外膜。由此可见，分枝杆菌细胞壁既具备革兰阳性菌的许多特征，也有革兰阴性菌的某些特性。
分枝杆菌细胞壁最显著特点为其所含有的分枝酸。在结核分枝杆菌中，分枝酸含有排列成α－分枝状、β－羟基化的70～90个碳原子。分枝酸的质量占分离细胞壁质量的50%以上，并通过有效的疏水性连接形成围绕细菌的类脂层，从而使细菌能以“类脂屏障”构成对已知药物的内源性抵抗力。
一、分枝杆菌细胞壁核心的结构
（一）细胞壁核心
分枝杆菌的细胞壁核心是指细胞壁中的不可溶性基质，即去除所有的可溶性蛋白质、类脂和糖类后所剩余的产物。它由共价键相连接的3种大分子所组成，即肽聚糖、阿拉伯糖半乳糖聚糖和分枝酸。这一大分子复合物的一重要方面是分枝酸首先以共价键与阿拉伯糖半乳糖聚糖相连接，然后再以共价键连接至肽聚糖。
（二）肽聚糖
分枝杆菌细胞壁核心中的肽聚糖位于最内部，紧接胞质膜，属于“化学型Ⅳ”型细胞壁，且与诸如大肠埃希菌属之类的其他细菌相类似。它是附着有四肽L－Ala－γ－D－Glu－Dap－D－Ala的聚糖［－4－β－D－GlcNAc－p－（1～4）－β－D－Mur－（1）］n。在四肽的侧链上，Dap－D－Ala和Dap－Dap交联都可发现。分枝杆菌肽聚糖合成应当对于β－内酰胺类抗生素易感。
（三）接头二糖
约有10%胞壁酸残基的碳－6（C－6）是肽聚糖通过接头二糖磷酸盐与多糖阿拉伯糖半乳糖聚糖连接点。分枝杆菌的此种二糖磷酸盐为分枝酸最终连接于细胞壁核心的第1个化合物。
（四）阿拉伯糖半乳糖聚糖
连接于单一接头二糖单位的复合多糖通称阿拉伯糖半乳糖聚糖，由D－阿拉伯糖呋喃糖（D－Araf）和D－半乳糖呋喃糖（D－Galf）残基所组成。自然界中的Araf残基只存在于放线菌科的多糖之中；D－Galf残基则广泛地存在于自然界，但不存在于哺乳动物细胞中，6层膜糖基残基结构的D－Galf是哺乳动物糖蛋白和糖脂的极为常见的成分。最近才弄清D－Araf和D－Galf残基的排列方式。现已发现，阿拉伯糖半乳糖聚糖的半乳糖聚糖片段是以交替的5－交联和6－交联β－Galf残基直接连接于接头二糖磷酸盐单位方式存在的同多糖（homopolysaccaharide），并由12～15个二糖重复单位所组成。Besra等认为有3个阿拉伯糖聚糖链连接至半乳糖聚糖骨架上。各位于6－连锁Galf残基的C－5位置上。阿拉伯糖聚糖链则连接至非常靠近接头二糖磷酸盐单位的同半乳糖聚糖链，由线性的6－连锁－α－D－Araf残基所组成，并通过3，5－连锁α－D－Araf单位在分支部位的存在而与5－连锁α－D－Araf残基形成分支。这些分支的阿拉伯糖聚糖链的末端则为特殊的五阿拉伯糖单位，其中二糖β－D－Araf－（1～5）－α－D－Araf分别连接至一α－D－Araf单位的C－3和C－5位置上，然后再连接至另一α－D－Araf单位的C－5位置上。可见整个阿拉伯糖半乳糖聚糖的结构较为复杂。
（五）分枝酸的连接
分枝酸位于分枝杆菌细胞壁核心。分枝酸系连接至末端五阿拉伯糖单位的末端和2－连锁Araf残基上。分枝酸单位在末端的五阿拉伯糖单位上都是以“4”成簇排列，而且仅约有2/3的五阿拉伯糖单位被替代，而其余1/3上则无分枝酸。Mc Neil等根据细胞壁核心的理化性质，提出了的细胞壁核心的三维结构模式。
二、与细胞壁核心有关的分子
（一）脂阿拉伯糖甘露糖聚糖
脂阿拉伯糖甘露糖聚糖（L A M）是包括结核分枝杆菌在内的所有分枝杆菌的一种脂多糖或脂聚糖。虽然L A M与细胞壁核心并无共价键连接，但它却是细胞壁中的一种重要部分，具有一些与革兰阴性菌O－抗圆性脂多糖相似的特性，如对T淋巴细胞活化的非特异性抑制和对人外周血白细胞抗原应答的抑制；也能抑制抗原呈递细胞的呈递过程和γ－干扰素介导的巨噬细胞活化。因此，L A M在病原体与宿主细胞相互作用上起作用，可下调各种类型的T细胞应答，成为免疫发病机制的先驱。此外，它在结核病和麻风病时也是一种B细胞免疫原。
L A M分子被还原的一端上有一磷脂酰肌醇单位。连接于肌醇C－5位置上的甘露糖聚糖骨架由在位置2上连接至t－α－D－Manp侧链上的线性6－连锁α－D－Manp单位所组成。阿拉伯糖聚糖侧链则以一种未明的方式连接至甘露糖聚糖骨架。有意义的是，这些阿拉伯糖聚糖竟然主要由与阿拉伯糖半乳糖聚糖的阿拉伯糖聚糖单位相同的结构单位所构成。然而与由分枝酸替代的不同，它们常以α－D－Manp，α－D－Manp（1～2）－α－D－Manp和α－D－Manp（1～2）－α－DManp（1～2）－α－D－Manp的形式与甘露糖单位替代。这些甘露糖单糖与在人类宿主中所发现的糖蛋白相似，提示这是“分子模拟”的一种重要生物学作用。
L A M中含有脂肪酸棕榈酸和10－methyloctadecanoate（tuberculosterate），这些都可在细胞的胞质膜中发现。此外，用超速离心沉淀法提纯的分枝杆菌胞质膜制剂中富含L A M。这些观察提示，L A M是通过其磷脂酰肌醇还原端固着于胞质膜的。至于多糖成分的位置，有可能多糖是以与革兰阳性菌脂磷壁酸相似的方式向外延伸，通过肽聚糖层到达细胞外。也有可能，LAM可在外流或分泌的不同时期中被发现，既可暂时存在于细胞壁内，也可存在于细胞外周围环境中。在结核分枝杆菌培养物滤液中也有一定量的LAM存在。
（二）海藻糖基础糖脂
海藻糖是葡萄糖的简单二糖［α－D－Glcp－（1－1）－α－D－Glcp］。酰基化海藻糖通过疏水性相互作用而与细胞壁核心中的分枝酸相连，故应在细胞壁的外缘。研究最为详尽者为海藻糖二分枝酸，通称索状因子，其中分枝酸盐连接至海藻糖的6－和6′－位置上。海藻糖二分枝酸具有多种生物学活性，其中多数与其诱导细胞因子介导过程的能力有关，如全身性毒性作用、抗肿瘤活性和趋化因子的巨噬细胞释放作用。也有发现它能抑制Ca2＋诱导的磷脂囊泡间的融合和白细胞的移动。
另一重要的以海藻糖为基础类脂的为硫苷脂。在这一分子中。海藻糖在2′位置上硫酸化，并由许多脂肪酸（phthioceranate，hydroxyphthioceranate）酰基化。Goren等证实了硫苷脂在许多结核分枝杆菌分离物对豚鼠毒力大小的作用。多数有毒力的菌株都能产生强酸性的硫苷脂，而减毒菌株则缺少此种物质，并有减毒指示类脂存在。以后认为硫苷脂的生物学活性取决于其对次级溶酶体与吞噬体融合的拮抗作用。目前一般认为硫苷脂因能抑制吞噬体活化，故而可促进病原体在细胞内的生存。
还有一类可在细胞壁内发现的主要以海藻糖为基础的类脂，通称酰基海藻糖。这些分子是一种由5个脂肪酸所酯化的海藻糖。这一家族中的非极性成员均含有5个酰基化集团，包括饱和直链C16和C18脂肪酰化集团和不常见的2，4，6－trimethyltetracos－2－enoic acyl集团（C27mycolipenic acid）。值得注意的是，mycolipenic acid只是在有毒菌株中发现，而且含有mycolipenic acid的类脂对于白细胞的移动表现一定的影响。这些酰基化海藻糖中的极性成员仅含有2个酰基化集团，即2，3－二酰基海藻糖（DAT）。此种海藻糖糖脂是极为异质性的，含有饱和直链C16－C19脂肪酸，C21－C25mycocerosate，C24－C28mycolipanolic acid的混合物以及少量C25－C27mycolipenic acid。DAT的一特殊成分直线脂肪酰化功能系位于海藻糖单位的C－2；而mycocerosate酰化功能则是位于C－3。此种简单的酰基海藻糖只是在结核分枝杆菌的有毒菌株中发现，并且具有高度的抗原性，因而有希望用于结核病的血清学检测。
最后，海藻糖可因加入的糖基以及酰化集团而被修饰。此种较为复杂的糖脂称为脂单糖（LOS），在很多型别的分枝杆菌中都可发现，如结核分枝杆菌的Canetti菌株、堪萨斯分枝杆菌（Mycobacterium kansasii）。因为这些糖基化海藻糖一般都具有抗原性，所以有人试图用其作为结核病的诊断。不过在其他有毒的实验室菌株，如Erdman或H37Rv菌株都不含有LOS。
（三）其他细胞壁糖脂
分枝杆菌细胞膜中一般含有3种类型的糖脂，不仅包括前述的LOS，也有糖肽类脂（GPL）和酚糖脂（PGL）。GPL为一糖基化的N－酰化四肽，常在鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）、细胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellare）和有关菌种中发现。目前尚未在结核分枝杆菌中发现。PGL是连接于一复杂类脂phenolphthiocerol dimycocerosate上的单糖，在牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）、堪萨斯分枝杆菌（Mycobacterium kansasii）、胃分枝杆菌（Mycobacterium gastri）、溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）、嗜血分枝杆菌（Mycobacterium haemophilum）和麻风分枝杆菌（Mycobacterium lep rae）等菌种中发现。Daffe等在结核分枝杆菌Canetti菌株中鉴定出含有三糖的PGL，三糖由2，3，4－三－O－甲基－α－L－Fucp（1－3）－α－Rhap－（1－3）－2－O－甲基－α－L－Rhap组成，其糖苷配基（aglycon）相当于phenolphthiocerol dimycocerosate。结核分枝杆菌Canetti菌株和牛型分枝杆菌尚可产生一种只有2－O－甲基－Rhap基团连接至phenolphthiocerol dimycocerosate的简单PGL。曾有人用单克隆抗体来检测临床细菌分离物中是否有此种PGL抗原存在。结果发现有64%的分离物对此抗原为阳性，而其中有25%的结核病病人为血清阳性。可见这一抗原在结核病的检测上有若干用处，虽这一抗原并不一定存在于临床细菌分离物之中。
（四）细胞壁蛋白质
分枝杆菌细胞壁中也含有一些具有较强免疫原性的蛋白质。有人曾证实结核分枝杆菌细胞壁中有一通过非共价键连接至肽聚糖的分子量23×103蛋白质。龟分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）细胞壁中的分子量59×103蛋白质则已鉴定为穿孔素。另一发现于细胞壁和整个细胞中的蛋白质为分子量45×103 Gro EL“伴侣蛋白”（chaperonin）。
（五）整个细胞壁模式
各种结核分枝杆菌糖脂都与细胞壁核心中的分枝酸以非共价键连接。分枝酸的垂直方向和非对称性双层结构的有关物理依据则主要由Nikaido等人提供。Rastogi等提出L A M也是固着于细胞壁的外面。其他有些研究者认识到脂肪酸与胞质膜的相似性，在亚细胞分级处理时膜中L A M纯化结果中提示，L A M在其存在的几种位置上，其中也包括一真正的分泌产物，是固着于胞质膜上，并且突出通过分枝酸层。关于蛋白质在类脂－多糖基质中的位置所知不多。
三、细胞壁核心的生物合成与药物的作用
（一）肽聚糖－阿拉伯糖半乳糖聚糖复合体的生物合成
分枝杆菌肽聚糖的生物合成大致与其他细菌相似。只不过对此只进行了少量的直接实验研究而已。
细菌糖类多聚体的生物合成过程需要有糖基供体、糖基受体和糖基转移酶。糖基供体多为糖核苷酸或连接于多异戊二烯磷酸盐（polyisoprene phosphate）的糖类。后一类脂糖类是由于糖核苷对多异二戊烯磷酸盐的糖基化而形成的。至于分枝杆菌阿拉伯糖半乳糖聚糖中有关阿拉伯糖和半乳糖供体的研究正在开始进行。阿拉伯糖多异二戊烯磷酸盐，β－D－Araf－monophosphodecaprenol已在分枝杆菌中鉴定，并证实可转移阿拉伯糖残基至内源性阿拉伯糖受体。关于半乳糖聚糖的生物合成，已证实糖核苷U DP－Galp可由分枝杆菌酶的提取物合成。因为分枝杆菌已知并不能合成任何含有Galp多聚体，只能合成Galf多聚体AG，所以很有可能UDP－Galp是Galf残基最终供体的前体。在一初步实验中发现，在有分枝杆菌酶类存在的情况下，UDP－14C－Galp能供应半乳糖残基至内源性半乳糖聚糖受体。可能UDP－Galp是通过酶的作用转化成UDP－Galf，然后再成为半乳糖供体。这种途径已在真菌青霉菌种中得到证实，但在分枝杆菌中则尚未发现有UDP－Galf的存在，α－L－Rhap－（1－3）－D－GlcNAc接头的糖供体可能是dTDP－Rha和UDP－GlcNac，因为在其他细菌中它们是Rha和GlcNAc的供体。这些糖核苷在分枝杆菌中存在已有一些初步的研究结果。
一般认为AG和LAM阿拉伯糖聚糖组成的生物合成来源是相同的。已证实GDP－Man和β－D－Manp－一磷酸多异二烯都在分枝杆菌中存在，且可能作为LAM甘露糖核心甘露糖供体（LM）而起作用。事实上一证实β－D－Manp－一磷酸多异戊二烯可将甘露糖残基供给各种受体，如α－甲基甘露糖或α－D－Manp－（1－6）－D－Manp。因此，这一供体可以成为LM骨架的来源。如前所述，LAM和LM的还原的一端为磷酸酰肌醇类脂固着点。甘露糖化磷酸酰肌醇已知为存在于分枝杆菌的糖脂，而且LM是这些磷酸酰肌醇甘露糖苷（PIM）进一步糖基化的产物。有关PIM生物合成研究提示磷酸酰肌醇系由GDP－Man甘露糖化而成。很可能甘露糖残基的具体供体为β－D－Manp－一磷酸多异戊二烯，然后再由GDP－Man甘露糖化。
虽然对于与AG和LAM生物合成有关的供体有所了解，但对这些多聚体如何合成的细节仍不清楚。多异戊二烯基二磷酸盐中间产物在脂多糖和外多糖（exopolysaccharide）的生物合成中较为常见，有可能这些产物在分枝杆菌中也是存在的。
（二）乙胺丁醇抑制阿拉伯糖半乳糖聚糖的生物合成
乙胺丁醇［（S－S）－2，2′－（ethylenedimino）di－L－butanol］是一种对分枝杆菌特异的重要抗菌药物。通过Takayama等人的研究得知这一药物能抑制细胞壁的生物合成，并且发现在加入此药后，［14C］葡萄糖在体内转变为阿拉伯糖聚糖的过程几乎立即受到抑制。因此他们认为乙胺丁醇的主要作用方式是抑制细胞壁中阿拉伯糖聚糖的合成。以上已得到证实，并已扩展至LAM的阿拉伯聚糖。近期研究表明β－D－Araffmonophosphodecaprenol的形成不多，提示乙胺丁醇作用于阿拉伯糖聚糖生物合成途径的晚期。最近证实乙胺丁醇通过阿拉伯糖酶的活性刺激阿拉伯糖残基由细胞壁中脱离。
（三）分枝酸的生物合成
Takayama等分离出和定性了导致分枝酸生物合成途径中的许多重要代谢中间产物，并根据在异烟肼（INH）治疗时所集聚的代谢中间产物而提出一种生物合成途径。这种途径包括4个步骤：①合成C26直链饱和脂肪酸，以提供C－1和C－2原子以及α－支链。②合成不饱和的和由环丙烷替代C40酸而成为C60酸［部分分枝酸（meromycolic acid）］，以提供主要碳骨架。③部分分枝酸骨架的修饰而导入另一功能性集团。④分枝酸的最后缩合过程。第一套反应是用简单的脂肪酸延伸反应机制而发生的（FAS－1和FAS－2）。第二序列反应需要在链的延伸后有δ－5－脱饱和酶对一C24酸的作用。此种特点提示，部分分枝酸以及分枝酸生物合成中的有关步骤为通过δ－5－脱饱和酶对C24脂肪酸的初级不饱和作用。但是至今尚未分离出最终缩合反应产物和反应中间产物。因此可以设想，n－C26直链饱和脂肪酸是在α－位置上羧基化形成二羟酸，再与部分分枝酸缩合，然后脱羧基化（可能是连接于糖载体）。所形成的氧化分枝酸产物后被还原成β－羟基集团和最终分枝酸产物。
（四）异烟肼抑制分枝酸生物合成
Takayama等证实IN H干扰C16以上脂肪酸的延伸过程，并发现IN H能特异地抑制δ－5双键插入C24脂肪酸。Laneelle等证实IN H敏感菌株的分枝酸合成受到IN H的抑制，而耐药菌株则不受影响。他们认为IN H能共价键结合至分枝酸合成系统中的主要组分，从而抑制其合成。
最近已克隆出与分枝杆菌IN H耐药性直接有关的两种基因。其中之一为kat G基因，它能编码触酶和过氧化物酶的活性。这种基因的突变导致IN H耐药性。相反，这一基因的导入又可使对IN H的敏感性恢复。可见katG基因在对IN H的易感性上是必需的。
第2个基因inh A则对触酶和过氧化物酶无作用。这一基因的测序结果证明与脂肪酸生物合成有关的大肠埃希菌酶env M有同源性。Inh A的基因产物与分枝酸生物合成有关，也是IN H、乙胺丁醇的主要作用对象。
（余传霖）
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