循环免疫复合物的检测

实验21　循环免疫复合物的检测

(Determination of circulating immune complex)

【目的】

了解循环免疫复合物(CIC)检测的实际意义。

【原理】

根据免疫复合物可通过经典途径激活补体的特性，将已知量的豚鼠补体与经56℃灭活补体的待检血清一起温育，再加入致敏红细胞，观察其溶血程度。根据溶血程度不同并与热聚合IgG阳性对照相比较来判定结果，据此可测知待检血清中免疫复合物的相对含量。

【材料】

1.绵羊红细胞。

2.溶血素(抗绵羊红细胞抗体)。

3.补体:新鲜豚鼠血清。

4.热凝集IgG制备:全部IC检测阳性对照可以用热凝集IgG。方法是:

(1)取Ig纯化IgG溶解在100ml(0.5mol/l)生理盐水中，置室温2～3h后，放63℃水浴箱中加热12min;

(2)取出后加入6.7g硫酸钠(缓慢加入，每次1g)，放4℃1h;

(3)取出后2000r/min离心20min，将沉淀溶解在适当的缓冲液中(如CPF缓冲液、C1q缓冲液)，透析一昼夜(一般可用含0.01mol/LEDTA和0.01mol/LPBS，pH7.2)，最后稀释至含蛋白约12～15mg/ml，－20℃备用，用时稀释至含蛋白为1mg/ml。

5. 0.4g/L硫酸铵。

6.补体结合稀释液(CFD)配方:巴比妥0.575g/L，巴比妥钠0.185g/L，NaCl 8.5g/L，MgCl₂0.168g/L，CaCl₂0.028g/L，pH7.2，4℃保存，用前再加明胶1g/L，NaN₃0.2g/L。

7.“U”形微量滴定板; 12×8“U”形孔。

8. 50μl加液器(最小刻度0.1μl)。

【方法】

1.致敏绵羊红细胞制备:取5ml羊血用CFD洗三次，用15mlCFD稀释;取0.2ml羊红细胞悬液加0.4g/L的硫酸铵溶液4.8ml并在比色计上(541nm)测定A值，按下式配成6％羊红细胞悬液:容积m l=(15×A值)/0.4g，再取兔抗羊溶血素(1∶150) 15ml，6％羊红细胞悬液15ml轻轻混合，置37℃15～20min，取出配成3％后放4℃可用24h，用前37℃预温。

2.补体滴定:

(1)取新鲜1∶10豚鼠血清按表21-1稀释(一个容积单位为50μl)。

(2)取上各稀释度液加入滴定板，每孔50μl，第8孔只加CFD50μl;再加2容积CFD到每孔，最后各加1容积致敏羊红细胞，用干燥玻璃板盖好，放微型振荡器上混均20min，37℃孵育;

(3)在置室温3～4h或在特制离心机1200r/min离心5min;

(4)最高稀释度无红细胞沉积为补体效价单位。

表21-1　补体稀释法

3.抗补体活性实际测定:

(1)在第一排(12孔)各加CFD1容积，第二排各加CFD1容积，为阳性对照;

(2)取标本血清按倍数由1∶2稀释1∶4096，第二排稀释热凝集IgG;

(3)各孔加CFD1容积;

(4)各孔加1容积补体(含2个效价单位，如效价为1∶80，2个效价单位为1∶40);混均、加盖，置4℃冰箱过夜(16～18h);

4.再加1个容积致敏羊红细胞到各孔，混均，37℃1h孵育后，取出置室温3～5h或特制离心机1200r/min离心5min。

【结果】

完全溶血，底部无细胞沉积　　0

大约75％溶血　　　　　　　　1

大约50％溶血　　　　　　　　2

大约25％溶血　　　　　　　　3

不溶血，大量红细胞沉于孔底　4

效价按反应结果等于“2”的最高稀释倍数确定，如稀释度为1∶128，效价即为1∶128。

【思考题】

CIC测定在某些疾病(如肾病)诊断中的意义有哪些?