鼠疫实验室及生物安全

第四章　鼠疫实验室及生物安全

一、当前生物安全所面临的问题

1．生物威胁　是指生物因子出现时，人类表现的忧虑或无法预测的严重危害及其后果。

2．生物战　是指用生物战剂挑起的战争。目前世界发达国家的生物武器相当先进，武器化能力很强；一些第三世界国家也掌握了生物武器，被称为穷人的原子弹；生物战一旦发生造成的灾难不可设想。国内外有关专家认为发生生物战的潜在危机正在增加，令人忧虑。如在鼠痘病毒的研究中发现，当把HL－2的基因通过克隆手段转入该病毒基因组中时，发现重组后的鼠痘病毒对实验动物的侵袭致病力增强，导致动物的死亡。原本想通过基因生物工程手段控制鼠害，但却为生物安全带来了隐患。因为在自然界，当鼠类感染了鼠痘病毒时，仅仅表现为不孕，并不能引起动物的急性发病及死亡。

3．生物恐怖　生物恐怖是遇到生物因子形成的危险和邪恶产生的极度恐惧。生物恐怖的特点是具有想象或未来时间较长的忧虑或恐惧。生物恐怖活动可利用的病原体种类很多、攻击面宽、实施手段多种多样、突然发生、真真假假难以预料和防护。

4．基因武器　指用基因工程研制的生物武器。现代生物技术的发展一方面为人类造福，另一方面也会被人利用发展武器。现代生物技术能改变生物战剂的攻击性能，改变其抗原性使之难以诊断；增强其致病性以加强杀伤力；增强其存活力以延迟攻击时间和扩大攻击面积；增强其抗药性造成治疗困难；改变其基因特性形成基因武器。专家推测，基因武器能够进行对人种的特异攻击。

5．实验室相关感染　由于从事实验活动而发生的与操作的生物因子相关的感染。在研究病原微生物中存在某种风险，如果在管理和操作病原体中一旦有所疏漏或错误就会发生实验室感染，造成威胁，进而可能造成病原体扩散或传染病的流行。

6．医院感染　医院感染也叫医院获得性感染或院内感染，指在医院内发生的一切感染。

7．人畜共患病人和动物间相互传播的传染病。人的传染病常常由动物传播，可通过接触经皮肤和黏膜感染，也可经消化道进入体内，更可通过气溶胶经呼吸道感染。

8．外来病　国外存在和流行的，国内尚未证实存在或已被消灭的传染病。

9．传染病　是指由各病原体引起的一组具有传染性的疾病。已有的一些烈性传染病还没有有效预防和控制，已经控制一些传染病有死灰复燃的势头，新的传染病不断出现，使我们面临挑战。

10．突发公共卫生事件　（简称突发事件），是指突然发生，造成或者可能造成社会公众健康严重损害的重大传染病疫情、群体性不明原因疾病、重大食物和职业中毒以及其他严重影响公众健康的事件。突发公共卫生事件的危害性和破坏性是多方面的，不仅危害公众身体健康和生命安全、造成公众心理恐惧，甚至导致社会混乱、经济衰退，威胁国家安全。

11．食源性传染病　指通过饮食媒介经消化道感染的疾病。第53届世界卫生大会上，世界卫生组织将食品安全列为重要议题，并指出食源性疾病与食品污染是不断扩大的公共卫生问题。在过去的20年里，食源性疾病的发生率明显上升。在发达国家，估计每年有1／3以上的人群感染食源性疾病。美国每年有7000万～8000万人患食源性疾病，其中32．5万人入院治疗，5000人死亡。

二、生物安全

1．生物安全实验室三项技术措施

（1）样品隔离技术（机械、气幕），防止传染因子进入环境接触人体

（2）定向流技术（三级负压系统），防止传染因子扩散

（3）消毒灭菌技术（物理、化学），灭活传染因子

2．硬件

（1）实验室设计建造

（2）实验设备的配置

（3）个人防护装备

3．软件

（1）标准化的操作程序

（2）管理规程

三、生物安全实验室

一级屏障是操作者和被操作对象之间的隔离，也称一级隔离。分Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级。

个体防护装备：口罩、面具、眼镜，防护衣、帽、裤、鞋、靴、袜、手套、正压服等。

二级屏障生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离，二级隔离的防护能力取决于实验室分区和定向气流。

实验室的设施结构：通风空调系统、给水排水系统、电气和控制系统。

一般按照实验因子污染的概率把实验室分为洁净、半污染和污染三个区。

美国联邦标准“洁净室与洁净工作台的环境标准”，以每28．32L空气中含有≥0．5μm的尘埃粒子数10²颗、10⁴颗、10⁵颗作为等级的名称，即100级、10000级（7级）、100000级（8级）。该等级换算成国际单位的每升粒子数则为3．5颗、350颗、3500颗。

洁净实验室不能代替生物安全实验室，洁净实验室仅提供了对样品的保护，100级洁净实验室是必需的。

生物安全实验室不允许正压，生物安全实验室有洁净度的要求，但要求不高。

四、我国生物安全相关标准

1．GB19489－2004，实验室生物安全通用要求，2004年4月5日发布，2004年10月1日正式实施。标准的编制主要参考了ISO 15190：2003（E）《医学实验室—安全要求》和WHO《实验室生物安全手册》。

2．WS－233，微生物和生物医学实验室生物安全通用准则，2002年12月3日发布，2003年8月1日实施。该标准参考美国CDC／NIH《微生物和生物医学实验室生物安全手册》1999年第四版制定。

3．我国生物安全相关标准

ISO 15190：2003（E）《医学实验室—安全要求》（国标转化中）

ISO 15189《医学实验室—质量和能力的具体要求》（认可准则CNAL AC23－2004）

4．微生物危害等级分类（与国外危害等级排序相反）

《中国医学微生物菌种保藏管理办法》（1985年，卫生部批准实施）

《实验室生物安全通用要求》

《病原微生物实验室生物安全管理条例》

5．微生物危害等级（GB 19489）

分级依据：微生物的致病性；传播方式和宿主范围；具有的有效预防措施；具有的有效治疗措施。

（1）危害等级Ⅰ　低个体危害，低群体危害

（2）危害等级Ⅱ　中等个体危害，有限群体危害

（3）危害等级Ⅲ　高个体危害，低群体危害

（4）危害等级Ⅳ　高个体危害，高群体危害

6．微生物危害等级（国务院条例）

《病原微生物实验室生物安全管理条例》分级依据是病原微生物的传染性、感染后对个体

微生物危害等级

或者群体的危害程度。病原微生物可分为四类。

一类是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。

二类是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。

三类是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。

四类是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。

第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。

各种病原微生物的危害等级分类参见卫生部《病原微生物名录》

病原微生物名录及生物安全评价（细菌、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、放线菌）

病原微生物名录及生物安全评价（病毒）

实验室概况—布局及流程

7．实验室生物安全水平分级根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将实验室生物安全防护水平（BSL）分为4级，Ⅰ级防护水平最低，Ⅳ级防护水平最高。

以BSL－1、BSL－2、BSL－3、BSL－4表示实验室的相应生物安全防护水平，以ABSL－1、ABSL－2、ABSL－3、ABSL－4表示动物实验室的相应生物安全防护水平。

五、鼠疫检验室的一般常用设备

生物安全柜、显微镜（包括荧光显微镜）、酶标仪、温箱、高压灭菌器、台式高速离心机、电泳仪、PCR扩增仪、紫外分析仪、细菌标准比浊管、数码照相机、滤菌器、中试管、持菌杆及白金耳、镍铬丝、玻璃缸、试管架、铁丝篓、培养皿、吸管、载玻片、凹玻片、盖玻片、酒精灯、放大镜、污物桶、平底烧瓶、三角烧瓶、pH比色计、有色玻瓶、茄形瓶、漏斗架或分注架、漏斗、量杯、量筒、天平、温度计、水浴锅、染缸、玻璃笔、离心沉淀器、华氏试管、沉降试验管、固定缸、接种动物饲养缸、玻璃珠、玻璃棒、滴瓶、滴管、外隔离衣、内隔离衣、三角巾、口罩、工作帽、手套（线及胶质的）、长筒胶靴、防蚤袜、解剖盘、解剖板、固定针、解剖刀、解剖剪、有钩镊、无钩镊、蚤管、洗手盆、乳钵、搪瓷缸、棉花、纱布、滤纸及其他用纸、麻线、煮沸消毒器（大小）、石棉铁丝板、磁凹板、标本盒、拭镜纸、洗涤球、实验动物饲养笼，恒温水浴箱、蒸馏器、干燥箱、洗手刷、洗瓶刷、试管刷、冰箱、喷灯、橡皮布、橡皮乳头、药勺、煮锅、绞肉机、注射器、针头、检蚤镊、标本缸、蚤拉胃针、有机玻璃微量板、定量滴头、定量稀释棒、金丝绒印布、圆盘电泳仪、鼠疫F₁间接和反向血凝试剂盒、鼠疫噬菌体、抗鼠疫丙种球蛋白、氯仿、细菌培养专用酵母粉、琼脂、胰蛋白胨、示蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碱性磷酸钠、尿素、七叶苷、甘油、液体石蜡、镜油、二甲苯、食盐、龙胆紫、甲醇、牛肉膏、过锰酸钾、吉姆萨染料、溴甲酚紫、酚红、中性红、石蕊、硝酸钾、乙醚、硫酸亚铁、硫代硫酸钠、醋酸铅、可的松、氨基苯磺酸、冰醋酸、对位二甲基氨基苯甲醛、过硫酸钾、尿素、明胶、碳酸钠、硫酸镁、磷酸二氢铵、枸橼酸钠、硫堇、L萘胺、结晶紫、煌绿、中国蓝、蔷薇酸、蒸馏水、盐酸、氢氧化钠、酒精、硫酸、重铬酸钾、碘片、碘化钾、碱性复红、美兰、甘油、无水酒精、石炭酸、氢氧化钾、生理盐水、鼠疫诊断血清、抗鼠疫噬菌体血清、亚硫酸钠、胃液素、各种糖醇类苷、来苏儿、滑石粉、升汞、福尔马林、凡士林、石蜡、羊毛脂、叠氮钠、氯化镁、草酸钠、氯化钙、刚果红、硼酸钠、单宁酸、丙酮、各种氨基酸、硫酸铵、各类核酸、实验动物（荷兰猪、小白鼠、家兔）。

六、鼠疫检验室工作制度

1．实验室各工作间应保持整洁，实验操作间必须杜绝外界动物、昆虫进入，如有发现立即消灭。

2．化验室工作人员每年须经一次以上鼠疫预防接种。

3．严格遵守国家生物安全相关法规及检验室操作规章制度和自身防护规则。

4．指定专人，按甲类菌种保管规则，管好菌种及有关材料。

5．强毒操作间必备配必生物安全柜，从事野毒株纯的培养物需在生物安全柜内进行。谢绝参观。

6．进入实验操作间工作之前需做好一切准备，入室后不得中途出入，严禁使用手机。工作要严肃认真并做好全面记录。

7．鼠疫强毒菌种的移植及其他有关实验工作，必须两人同时在生物安全柜内操作。

8．一切有关鼠疫的检验操作及实验研究，均须严格遵守自身防御规则，工作中如果发生事故应立即处理并报告负责人。

9．化验室工作人员应根据自己的任务各负其责，并互相协作。若因工作调动，必须办好交接手续，健康观察7天无异常反应方可离开本地到他地，若因特殊情况必须立即离开者要求服三天磺胺类预防药。

10．鼠疫强毒室必须在进入前和工作完毕后各进行30min的紫外线消毒。工作完毕后要进行卫生清理，保持检验室的整洁。解剖后动物尸体的处理要严格执行国家有关的规定，鼠疫菌的培养物一定要高压灭菌处理。血清拿出强毒室时，要首先密封在安瓿内，经消毒和灭活后方可拿出。同时要实施安全检查，并做好保卫工作。

11．检验室污水的处理和排放要严格执行国家有关的规定。

12．强毒室的设计要有消防安全通道，并配备灭火器材。

七、自身防御规则

凡进行鼠疫微生物工作者，除每年应接受一次预防接种外，还必须遵守下列规则：

1．凡进行鼠疫剖验、菌种移植和实验研究（包括接种动物的培养观察），于入室操作之前须在第一更衣室脱去不需要的衣物，然后在第二更衣室按下列顺序穿着防护服装：①扎三角头巾；②穿隔离衣裤；③穿防蚤袜及长筒胶靴；④穿工作服；⑤戴大口罩；⑥戴胶手套及线手套（必要时戴防护眼镜）。工作完毕外出前将双手（戴着手套的）浸于3%来苏儿液内1～3min。外出后立即锁门并到第二更衣室按下列顺序卸装及消毒：①脱线手套、脱口罩、（脱眼镜）脱工作服、脱三角头巾、脱胶手套，分别浸泡于消毒液内；②在2%来苏儿液内洗手；③脱胶靴、防蚤袜及隔离衣裤；④用肥皂、清水洗手；⑤用酒精棉球擦手；⑥用3%硼酸水漱口。

2.进行强毒菌动物实验等工作须每日测体温，必要时服用预防药。

3.鼠疫动物尸体必须在实验室内用10%来苏儿液浸泡10日以上，然后取出送焚烧炉烧毁或深坑掩埋（坑深3米以上，并加盖漂白粉及石灰）。一般动物尸体则用3%来苏儿液浸泡3昼夜后，取出掩埋。

4.使用后的平板、斜面等一律先在室内经过5%来苏儿浸泡5昼夜，其他细菌培养物或污染物品亦需浸泡3昼夜，始得携出室外清洗。

5.检验工作间之空气、地面、桌凳于每次工作前后均应以紫外线灭菌，每次30min，无紫外线设备时则于工作完毕时以3%来苏儿喷雾消毒。鼠疫实验动物饲养间亦应定期实施终末消毒。

6.检验工作人员在参与检验工作期间，如果发生原因不明热症时，必须立即隔离进行确诊。

八、疑似鼠疫材料的输送

按照中华人民共和国卫生部（57）卫防字第483号通知关于《邮寄菌种毒种及有毒性物品包装规格的办法》规定鼠疫等强毒菌种严禁邮寄，因此疑似鼠疫材料原则上应就地进行检查确诊，条件不具备时则应将该材料置于保存液内（保存办法见前述）严密封装，外面包以浸过来苏儿之棉花，然后将装此材料的小瓶置于铁筒内，焊封后装入垫有棉花、废纸或木屑之木箱内，派专人运送。

九、鼠疫菌种的保管及鉴定

一切由啮齿动物、人或其他动物生体或死体分离的鼠疫菌种皆应仔细研究，在未经彻底研究之前均应冻干保存。

关于鼠疫菌种的保管，根据中华人民共和国卫生部｛54｝卫防字第1583号通知及（78）卫防字32号《关于鼠疫菌种管理的暂行规定》执行。各地分离的鼠疫菌种和噬菌体应及时送交省、自治区的防疫专业机构，待鉴定后即行销毁。省、自治区专业机构应对本省、自治区分离的菌种做好全面鉴定和冻干。每年将情况向卫生部报告一次，同时抄送指定单位。并选出有保存价值的菌种送交青海省地方病防治研究所。各省、自治区专业机构可根据要求，保存本地区菌种供本单位研究使用，但没有发放任务。索取菌种须持省、自治区卫生厅或总后卫生部公函经卫生部批准到青海省地方病防治研究所领取。保存菌种要建立档案、卡片、账目。菌种档案应有专人负责严密管理。保存菌种应有专设培养箱、冰箱、生物安全柜和房间，并应加锁。长期保存时必须放置在结构坚固，有防空、防震效能的建筑物内，以确保安全。保存菌种应选择政治可靠，责任心强，有强毒操作经验的人员专责管理。运送鼠疫菌应由政治可靠，责任心强的专业人员二人专程负责，不得邮寄。包装参照第一章第十三节所述并注明鼠疫毒菌、运送单位、运送者姓名。运送时要乘坐安全可靠的交通工具，途中不得耽搁，确保安全到达。

至于鼠疫菌种的鉴定，除菌形、培养特性、噬菌体裂解试验、毒力因子检查和毒力测定外，要作生物化学性状的检查。生化性状包括硫化氢、靛基质、硝酸盐还原、尿素分解试验和糖、醇类发酵试验。还应进行阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、密二糖、甘油、山梨醇、水杨素及松三糖的发酵试验，一律取37℃观察7天，再置室温继续观察7天的结果。

十、WHO公布的全球实验室感染的情况

实验室相关感染

实验室感染途径

十一、鼠疫实验室

B2可以用于生物安全Ⅰ~Ⅲ级的样品，如病原微生物，以及在这些微生物研究中用到的挥发性有毒化学品及放射性核素

鼠疫强毒室的设计必须达到国家病原微生物实验室的条件和安全要求。必具生物安全柜，同时必须确保外界动物（包括野栖啮齿类、家栖啮齿类、猫等）及昆虫不能进入该室。必须有充足的房间，以便布置感染性的和非感染性的工作间并注意这两个系统的严密隔离，感染性的工作间有检鼠、检蚤室（鼠蚤分类、集蚤）、解剖室、细菌室（细菌培养物在生物安全柜内进行）、实验动物接种饲养室及必要空间的缓冲室，这些工作室是互相联系的，是一个系统，其出口便是更衣消毒室。非感染性的房间有培养基制作室，血清学检查室，健康动物饲养室，洗涤消毒室等。这是另一个系统，不得与感染性的工作间混杂相间。但洗涤室可与感染性的更衣消毒室联系以便利工作之进行。农村小型化验室，或临时移动性的化验室条件不够时，可将某些工作室合并或以帆布隔开使用，但亦必须严格区分感染性的和非感染性的工作间。同时要防止捕获后鼠体寄生蚤的游离及叮咬人的发生。所以鼠疫的生物安全，应从鼠的捕获及途中运送、蚤的采集开始，不仅仅只是实验室的生物安全。严禁在没有进行蚤处理的前提条件下，直接从事鼠疫解剖及其相关的检验活动。鼠体蚤的处理可采取熏蒸、麻醉及鼠体表喷洒杀虫剂的方法收集。

十二、中国现有的鼠疫实验室的分类

1．野外条件下的简易鼠疫实验室，应结合我国国情及实际情况制定相应的实验室及工作流程规范和标准。同时制定严格的污水和动物解剖后尸体的处理方法。

2．县级普通的鼠疫强毒实验室，应结合目前国家级鼠疫监测点实验室的实际情况制定相应的实验室规范和标准，配备A2型台式生物安全柜。同时具备污水处理系统和焚烧炉。

3．生物安全Ⅱ级实验室，省或自治区级鼠疫强毒实验室必须达到的标准，配备B2型台式生物安全柜。

4．生物安全Ⅲ级实验室，国家级鼠疫实验室，必须达到《病原微生物实验室生物安全管理条例》的要求和标准，包括青海、云南、吉林等省。

5.生物安全Ⅳ级实验室，在从事鼠疫野毒株方面的动物感染试验时，必须执行《病原微生物实验室生物安全管理条例》的要求和标准。

十三、消毒

对病人污染的物品和场所要进行终末消毒。从事病原学的试验室必须具有生物安全柜和逐渐达到二级生物安全的标准。消毒药品可选择来苏儿、石炭酸、新洁而灭、戊二醛、含氯消毒剂、过氧乙酸、环氧乙烷等。试验室以75%酒精为基本清洁液。