鼠疫菌的变异

第七节　鼠疫菌的变异

细菌的变异可涉及到多个方面，如形态、菌落、毒力、生物膜、耐药性、抗原性、代谢途径及代谢产物等。如细菌在不适宜的温度、酸碱度、盐类浓度、化学药品或免疫血清等不利的环境中生长后，在形态结构上，常可出现多形态与衰残型（退化型）。但这些变异最终都归结为染色体和质粒DNA的突变。特别是细菌生物膜的形成，近年来备受关注。研究发现一些呼吸道病原菌，一旦以生物膜的形式被吸入肺部后，细菌就会黏附在肺泡上皮细胞上存活，并抵抗或干预机体的免疫防御的机制，引起疾病的迁延不愈和肺组织的纤维化。同时造成抗生素作用位点的消失。新分离的鼠疫菌不形成色素，形成色素是变异的象征，这种现象偶尔在保存时间较久的培养基上可以看到。一般突变会导致所编码蛋白质的改变，从而使细菌出现新的特性或失去原有的某些特性。细菌的自然突变率与其生物的自然突变相同，每10⁶～10⁸次细胞分裂发生一次。由于细菌每20～30min分裂一代，故突变株相对较多。

早在1928年英国科学家Griffith等人就发现肺炎链球菌使小鼠致病原因是引起肺炎。细菌的毒性（致病力）是由细胞表面荚膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表的R型因为没有荚膜多糖而失去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞攻击）。首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。Avery等人将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。解剖死鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分转化进入无致病力的细菌，使无致病力的细菌转化成病原细菌。

一、鼠疫菌的种内变异

鼠疫菌在自然界的进化过程中，已形成了若干变种。至于其他种内变异形式，最常见的是生态位改变，其次还有生化变异及毒力变异。

（一）租糙型（R型）和平滑型（S型）的变异

鼠疫菌和大多数微生物种相反，其基本型是粗糙型而不是平滑型。

1．粗糙型的特征

（1）在琼脂平板上，菌落呈粗糙的颗粒状，色淡、中央昏暗、周边较明亮，有锯齿状边缘。

（2）在肉汤中形成菌膜及沉淀，肉汤不混浊，静置久后可见钟乳石状发育。

（3）在琼脂和肉汤培养物的涂片中，可见鼠疫杆菌特有的细胞特征。琼脂培养物中，鼠疫菌为多形性的两端钝圆杆菌，具有两极浓染，尤以润湿培养物或凝固水做成之涂片，此种特征更为明显。肉汤培养物则为两极浓染的杆菌彼此排列成长短不等的小链。

（4）琼脂培养物不易做成完全均匀的菌悬液。粗糙型一般具有毒力，有致病性；但失去毒力的鼠疫菌的粗糙型也不具有毒力。

2．光滑型的特征

（1）在琼脂平板上菌落光滑，圆而隆起、边缘整齐，几乎无色，结构柔嫩。

（2）在肉汤中呈均匀混浊。

（3）在琼脂和肉汤培养物的涂片中，能看到通常之鼠疫菌比粗糙型要大些。肉汤中菌呈散在，很少呈链状。

（4）琼脂培养物能做成均匀的盐水悬液。

3．过渡型的特征

此外鼠疫菌还有过渡型，即粗糙过渡型（OR型）与光滑过渡型（OS型）。

（1）粗糙过渡型的特征是：在琼脂平板上，菌落粗糙，色调很浓（黄色、褐色、棕色），颗粒状或凸凹不平，边缘不整齐，菌落周边致密而不透明，在肉汤中形成菌膜并沉淀；具有毒力。

（2）光滑过渡型的特征是：在琼脂平板上形成的菌落颇为粗糙，几乎无色，呈颗粒状或凸凹不平，边缘不整，周边致密而不透明，在肉汤中形成均匀混浊；毒力弱。

这两种过渡型均以菌落形态的多样性为特征，因而二者很难找到差别。如果遇到可疑时，就要根据它在肉汤中的发育状况来决定。应当指出粗糙过渡型要比光滑过渡型多见。此等过渡形态常见于兽疫流行末期和患迁延型鼠疫的啮齿动物的脏器培养物中。在跳蚤体内也曾屡次分离出来过非典型的鼠疫菌。鼠疫菌解离为S型和R型的现象也曾见于豚鼠、子午沙土鼠和小家鼠体中。在腺鼠疫患者病后十天合并继发性肺鼠疫而死亡的尸体中，亦曾观察到鼠疫菌解离为R型和S型。

（二）毒力的变异

在普通的人工培养基上培养的鼠疫杆菌，通常其毒力逐渐消失。其中一些菌株毒力消失得快而另一些菌株又消失得慢。B．M屠曼斯基等的毒力研究证实，在人工培养基上保存了3年的120株中，完全失去毒力的占9．1%；而在同样培养基中保存了10年或更久的112株中占76．9%；仅保存1～2年的17株当中，却没有一株变为无毒的，尽管其中有些菌株毒力显著降低。上述资料非常明显地证明了在改变了的外界条件影响下，鼠疫菌失掉了基本特性。

过去认为已经失掉毒力的R型鼠疫菌，是不能恢复其毒力的，即使在豚鼠和其他实验动物身上做多次传代亦认为无济于事。但近年来有人用EV菌株连续通过蒙古鼠兔传递4～11代，使毒力得到明显提高；对小白鼠皮下接种10个菌，豚鼠接种100～1000个菌，均可引起动物死亡。此外，将无毒鼠疫菌同含有铁离子的溶液一起接种小白鼠，亦可导致动物死亡。

关于在人工培养基上鼠疫菌毒力的变异问题研究者甚多：J．E．Ogg等认为在37℃下通气的肉汤培养基有利于无毒变异细胞生长；降低氧压，如在含有还原物硫乙醇酸钠的培养基则能防止毒力的减弱。Hguchi．K．and．SmithJ．L等称鼠疫毒株于缺乏钙离子的肉汤培养基内，在37℃培养时即将失去毒力，但若加入适当量的钙离子即可防止。其解释是整个培养物中的少数无毒菌细胞于钙离子缺少的情况下，迅速繁殖并超过原有有毒菌细胞的结果。

幼稚的鼠疫菌培养在含有噬菌体的人工培养基上发生变异的事实已毋庸置疑。波克洛夫斯卡娅等把鼠疫菌的有毒株培养在含有噬菌体的培养基上，很容易就变成了无毒株，但此时它们不仅失掉了毒力，并且也失掉了抗原性。

在自然界中，从啮齿动物及其体外寄生虫内分离到的鼠疫菌也可看到毒力变异情况；自然界中几乎每一株菌都是由各有其特点的细胞组成的。以毒力决定子为例，从自然界分离的鼠疫菌几乎每一株中都有P^＋、P^－；VW＋、VW－；F₁^＋、F₁^－细胞。在自然界中，不同的地区或不同年代的流行中，甚至在同一次流行的初期和末期，毒力的差异都是很大的。

鼠疫菌在感受性低的动物体内以及虽有感受性但已免疫的啮齿动物体，均能使毒力减弱；但通过易染机体则使毒力增高。

自然界中鼠疫噬菌体的存在也是促使鼠疫菌毒力变异的因素，如伴有鼠疫噬菌体的菌株，常系非典型的鼠疫菌。但是也不能否认，并非所有的鼠疫菌变异形式都与噬菌现象有关。如甘油阴性菌株变为甘油阳性菌株这样深刻的变异，就没有噬菌体参加。

（三）生化特性的变异

长期培养在人工培养基上的鼠疫杆菌，它们在分解鼠李糖方面的能力将越来越活跃。把原先不分解鼠李糖的菌株在含有鼠李糖的培养基上传代，亦能获得这一性质，经过多次传代之后的菌株只消几昼夜就能将鼠李糖分解，而与假性结核杆菌相差不多。不只是甘油阳性株在人工培养基上长期培养时，能获得分解鼠李糖的能力，甘油阴性株亦然。鼠疫杆菌在含有鼠李糖的培养基上传代后获得分解鼠李糖的能力，说明鼠疫杆菌的变异是和培养基的组成，也就是和外界条件有关。鼠疫杆菌在含有鼠李糖的培养基上培养时，能改变它的同化型即物质代谢型，因而也就改变了它的遗传性。

鼠疫杆菌家鼠变种不分解甘油的特性是相当稳定的。1939年B．M屠曼斯基氏看到了有3株家鼠变种在普通培养基上长期传代后，能分解甘油，我们也看到了这种现象。但如把不分解甘油的家鼠变种在甘油琼脂上传代，虽也能变为甘油阳性，却比改变鼠李糖阴性为鼠李糖阳性要困难得多。用通过动物体的办法，顾切罗娃和贝里果二氏曾成功地将甘油阴性株通过小黄鼠转变为甘油阳性株；甘油阳性株通过柽柳沙土鼠转变为甘油阴性株。俞东征曾用分离自云南剑川大绒鼠的甘油阳性菌株，通过黄胸鼠59代后，出现甘油阴性株。

云南流行病防治研究所（1973）曾报道，68株甘油阴性鼠疫菌株，通过长期实验室传代保存（培养基传代保存11年，冻干保存7年）后，有10株变为甘油阳性株。这些菌株原来均不能发酵蔗糖、乳糖和鼠李糖，通过18年的保存，发现3株发酵乳糖，5株发酵蔗糖，4株迟缓发酵鼠李糖。除这些菌株外，还有少数几株菌对这几种糖、醇的发酵表现为时而出现，时而消失，表现为“遗传的相对不稳定性”。内蒙古鼠疫防治研究所也曾发现3株原能发酵麦芽糖和糊精的鼠疫菌，在室温保存了14～17个月后，丧失了分解麦芽糖和糊精的能力。

研究鼠疫菌的变异具有重大的实际意义，它不仅与判断疫情、探索疫源、解决鼠疫流行病学有极大的关系；而且在寻找新的菌苗菌株，使它向着我们所需要的方向定向变异也有一定的研究价值。

二、鼠疫菌的种间变异

鼠疫菌的变异不仅限于种内变异，一些鼠疫工作者还研究了鼠疫菌更深刻的变异——种间变异。

早在1936年从受噬菌体作用过的无毒菌株中，获得的9株在48h内分解鼠李糖但不被鼠疫噬菌体所裂解。1937年也获得了在鼠疫噬菌体作用下发生了深刻变化的鼠疫菌。此菌株与鼠疫噬菌体的关系和假性结核杆菌是一样的。它的全部培养特性，生化特性和免疫学等方面与假性结核杆菌是一样的。

1938年屠曼斯基等还看到一株鼠疫菌由于在普通培养基上培养的结果，改变了自己的基本特性，以至于在培养、生化以及免疫方面与假性结核杆菌已经没有什么不同。不过还保持着高度的抗原性，因为用本株细菌免疫后的豚鼠，用鼠疫菌做实验传染时不发病。

1951年列斯卡娅报道当同种噬菌体存在时，她看到3例鼠疫杆菌变成假性结核杆菌，同时她从AMJI株中也获得了假性结核杆菌。

1963年于思庶等以鼠疫菌EV株在人工条件下通过1%抗假性结核血清肉汤培养基传40代后，再通过1%抗鼠疫血清肉汤或1%抗假性结核菌血清肉汤传代，30代都获得具有典型假性结核菌特征的变种。

由此可见鼠疫菌的种变异，通常是向着假性结核菌方面，这种变异在陈旧培养物中可以自然地产生；在幼稚培养物中可用噬菌体作用而产生；也可以由于抗血清的作用导致代谢过程的改变而出现。

这种变异不仅见于试管内而且也见于动物体内。屠曼斯基氏等在1944年首先看到了鼠疫菌在动物体内的种形成的变异现象。这个变异菌株系来自两次感染鼠疫菌（第一次大量感染无毒鼠疫菌，第二次感染有毒鼠疫菌，315天后杀死）的豚鼠肝脏培养物，经同原始菌株和假性结核菌进行仔细研究，发现这个菌株像假性结核杆菌，而不像鼠疫菌。

耶尔森氏菌强毒株都在染色体上带有一毒力岛，其中鼠疫菌强毒株带有35kb的强毒力岛（HPI），G＋C Mol%为59。外缘与asn－tRNA相连，末端具有DR17，一端有IS100，与色素沉着区紧密连锁，共同构成了不稳定的102kb的Pgm位区。内含杆菌素的合成基因、摄取基因及调节基因，构成了杆菌素介导铁摄取系统。HPI不能发生精确切除，通常是由Pgm位点两侧的IS100之间的同源重组而自发丢失的，发生的频率为10^ˉ5。

据张涛报道，我国沙土鼠鼠疫疫源地的菌株，在动物鼠疫暴发流行初期和末期，个别分离的毒株毒力极弱，只有现行鼠疫菌苗株毒力的1%～1‰；这些弱毒株都含有鼠疫菌特有的9．5、70、110kb 3种质粒，很可能是其染色体DNA中重复插入序列之间发生了重组，导致菌株毒力的丢失。而在动物鼠疫暴发流行期，分离的野毒株毒力普遍较强。

三、鼠疫菌质粒方面的变异

董兴齐等（1994）用琼脂糖凝胶电泳技术，检查了分离自云南的828株鼠疫菌质粒DNA特征。结果表明，云南省鼠疫菌可观察到分子量为3．93、6．22、97．35、65、45、35、64．82、74．59、111．36和129．55Mdal 9种质粒，按质粒组成可划分为1~X种质粒图谱。被检菌株中，99．15%具有6、45和64．82Mdal质粒，还发现21．62%、4．59%、1．54%和3．5%的菌株分别尚存3．93、22．97、35．65和111．36Mdal质粒，这些质粒有特定的分布区域，具有重要的分子流行病学意义。根据质粒，可将云南省鼠疫现有疫区初步划分成滇西北山地、保山盆地、大盈江、陇川江、南定河、澜沧江下游和红河元江段流域7大相对独立的疫源地。还发现5株鼠疫菌缺失规范化质粒，其中64．82Mdal质粒缺失为国内首次报道。他们还通过检查各质粒代表株的毒力、毒力决定子和生化特性，表明3种规范化质粒与菌株的毒力和毒力决定子相关，与生化特性无关。其中，6．05Mdal介导着Pst的产生；45．35Mdal质粒编码着VW；而64．82Mdal质粒决定F₁抗原的产生。其中3．93Mdal（6kb）质粒为家鼠疫源地特有。

在对我国1326株鼠疫菌的研究中发现，仅1株缺失F₁、6株缺失PstⅠ，Pgm和VW阳性分别为92．99%、76．47%。我国不同疫源地、不同生态型和不同年代分离的野生型鼠疫菌绝大多数能产生F₁和PstⅠ，且不同生态型和不同疫源地分离的菌株这两种毒力因子无明显差别，性状稳定。VW－和Pgm^－菌株与生态型及疫源地有一定的关系。经长期人工培养传代后，4种毒力因子相比，Pgm因子较VW因子更容易发生突变。在我国沙土鼠疫源地分离的鼠疫野毒株，即使同一个野鼠脏器压印培养分离的菌株，都同时含有两种类型：Pgm^＋和Pgm^－表型的菌株；研究发现，所谓的强毒株只是Pgm^＋的表型所占比例大于60%，而弱毒株Pgm^－表型所占比例较高。从另一个方面说明，鼠疫菌皮下接种方式毒力测定的结果，完全由Pgm表型决定。