分子生物学诊断

由于技术手段的局限，最初的疾病诊断大多以疾病所致的各种体征为依据的“表型诊断”。这种方法有许多缺陷，对不具特异性的表型改变，或者表型改变出现较晚时容易误诊，错过最佳治疗时机。分子生物学技术为临床疾病提供了新的诊断手段，通过直接探查基因的状态及功能产物，以及基因型的改变对疾病做出可靠诊断，甚至可以在无任何症状的情况下进行精确预诊。所以分子诊断技术必将推动临床诊断飞速发展。

分子诊断的优势在于其集中了高度精确性、高度敏感性和高度集成性的特点。分子诊断用于研究基因差异表达，可以对有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测；分子诊断用于患者的基因组分析不仅可对某些疾病做出准确检测，还能对疾病的易患性、发病类型和阶段做出判断；分子诊断用于病原微生物基因测序，可快速检测不易在体外培养（如各种病毒、真菌和厌氧菌等）和不能在实验室安全培养的病原体，并可对病原体进行基因分型。

（一）诊断技术

通过多年的探索和实践，分子诊断的各项技术已基本成熟，虽然离临床大规模应用仍有一定距离，但由于分子诊断具有众多明显优势，相信会得到越来越广泛的应用。目前部分常用的技术有以下几种：

1.遗传多态性连锁分析 人类基因组DHA具有多态性，多态位点本身并不致病或与遗传病无直接关联。但其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠得很近，并呈孟德尔式连锁遗传。因此可利用这些多态性位点，如限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VHTR）及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SHP）等进行多态性检测并分析数据，可间接确定致病基因。

2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）及其衍生技术 PCR是目前使用最多的DHA诊断方法，并且在其基础上衍生出了许多便捷而灵敏的分子诊断方法，例如PCR-RFLP、单链构象多态性PCR（single strand conformation polymorphism PCR，SSCP-PCR）、等位基因特异PCR（allele specific PCR，AS-PCR）以及短串联重复序列PCR（single tandem repeat，STR-PCR）等方法。尤其STR-PCR分析通过特异性扩增致病基因内部的短串联重复序列并在家系内作遗传连锁分析，可用于精确检测与微卫星多态性标记连锁的疾病。PCR技术和蛋白质免疫技术结合产生了新型的免疫PCR基因探针，可对基因的表达产物进行诊断分析。由于它集中了免疫反应的高特异性和PCR反应的高灵敏性两者的优点，有较大的推广价值。

3.DHA序列分析 DHA序列测定是诊断已知和未知突变基因最直接可靠的方法，上述各种方法的诊断结果都可以用测序来进一步验证。PCR技术的应用，使DHA测序从过去的克隆后测序进入扩增产物直接测序的新阶段。新近发展起来的双链DHA循环测序法以5’端标记的测序引物组合进行PCR扩增，通过多次变性、复性、延伸的循环进行测序，具有快速、简便灵敏、重复性好等优点。但是由于测序法所需特殊仪器和高昂的费用使得它目前尚难在临床诊断中普及。

4.荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 对于因染色体数目或结构异常（如染色体组成倍增加，个别染色体整条或其节段的增减以及位置改变等）所造成的遗传病，一般涉及较多的基因，此时需要利用FISH技术来进行染色体上的定位。目前在FISH技术上衍生了一些新的技术：多色FISH可使一个细胞核中的全部染色体各自显示不同颜色，清楚地显示复杂易位的情形；全周期FISH技术可以显示悬液中间期DHA的三维结构。FISH技术已经在肿瘤、遗传病的分子诊断等领域中大显身手。

5.基因芯片 基因芯片（gene chip）是将大量序列已知的寡核苷酸分子、基因片段应用特殊的微阵列技术固定在玻璃、硅片、塑料等材料上，被测片段经荧光等物质标记后与芯片上的探针分子结合，通过激光共聚焦扫描仪对各阵列荧光信号的强度进行检测，对大量标本的序列特征、基因表达量或表达差异等进行平行分析的一种技术方法。基因芯片不仅可用于致病突变的检测，由于基因芯片有样品处理能力强，自动化程度高，检测靶分子种类多的优点，尤其适用于基因表达谱的研究，例如创伤后机体在应激状态下很多基因呈一过性表达，利用基因芯片技术可以实现高通量自动化的数据处理，研究整体水平的基因表达调控，这在以前是难以想像的。

（二）临床应用

最初的分子诊断主要用于遗传性疾病，但随着技术的进步，分子诊断在临床上的应用越来越广泛。

1.病原微生物检查 以往临床上需要对细菌、病毒等病原体的感染进行检查时，需要进行实验室培养，不仅周期长，而且结果易受污染。实际上通过对病原体基因组某一特定区域进行PCR扩增并测序，就可对其加以鉴别，甚至可以同时对病原体的耐药性、变异型等情况进行检查，大大节省时间，提高效率。

2.肿瘤诊断 基因芯片已用于检测人肺癌基因表达谱、肿瘤原癌和抑癌等基因的发现和定位。在人类恶性肿瘤中，约有60%与人类抑癌基因的突变有关。现已有集成了p53基因全长序列和已知突变的探针芯片，可检测p53基因所有编码区错意突变和单碱基缺失突变，监测正常人群中p53基因的差异表达，对其肿瘤易感性做出诊断，以达到早期诊断、将恶性肿瘤消灭在萌芽状态的目的。