中药有效成分的分离与精制

1．根据物质溶解度差别进行分离

（1）结晶法

①概念：将不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作叫结晶；从不纯的结晶经过进一步精制处理得到较纯的结晶的过程称为重结晶。

②重结晶法中溶剂的选择：选择溶剂时必须考虑到溶质的成分与结构，根据“相似相溶”原理，极性物质易溶于极性溶剂中，难溶于非极性溶剂中；非极性物质则相反。

③判断结晶纯度的方法

a．结晶形态和色泽：一个纯的化合物一般都有一定的晶形和均匀的色泽。虽然结晶形态可随重结晶条件（如溶剂等）的改变而有所不同，但结晶形状总是均一的。如看出结晶形状不均一，就可判断该结晶不是单一的化合物。当然，结晶形状均一时也不能完全肯定就是单一化合物，还必须与其他检查配合。

b．熔点和熔距：鉴定时要注意重结晶前后的熔点是否一致，如果重结晶后的熔点比重结晶前高，说明还需再一次重结晶。熔距是指晶体从开始收缩到完全融化或分解的温度差。一般单一化合物的熔距很窄，在1～2℃的范围。

c．色谱法：色谱法是鉴定结晶纯度的一种常用方法。常用的色谱法有纸色谱、薄层色谱和高效液相色谱法（2008年）。单一化合物在纸上或薄层上点样后经过展开和显色，一般只应观察到一个斑点（三种展开系统下）。

（2）在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。

如在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水/醇法）（2012年）；或在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/水法）（2012年）等。

（3）对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸或碱以调节溶液的pH，改变分子的存在状态（游离型或离解型），从而改变溶解度而实现分离。

例如，一些生物碱类在用酸性水从药材中提出后，加碱调至碱性即可从水中沉淀析出（酸/碱法）。

（4）酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。

例如酸性化合物可做成钙盐、钡盐、铅盐等；碱性化合物如生物碱等，则可做成苦味酸盐、苦酮酸盐等有机酸盐或磷钼酸盐、磷钨酸盐、雷氏盐等无机酸盐。得到的有机酸金属盐类（如铅盐）沉淀悬浮于水或含水乙醇中，通入硫化氢气体进行复分解反应，使金属硫化物沉淀后，即可回收得到纯化的游离的有机酸类化合物。

2．根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 常见的方法有简单的液-液萃取法、逆流分溶法（CCD）、液滴逆流色谱法（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、气液分配色谱（GC或GLC）及液-液分配色谱（LC或LLC）等。以下就液-液萃取的基本原理及方法作一简单概括。

（1）液-液萃取法

①液-液萃取与分配系数K值：将两种相互不能任意混溶的溶剂（例如氯仿与水）置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定的温度及压力下为一常数，可以用下式表示：K＝CU / C L

K：表示分配系数；CU：表示溶质在上相溶剂中的浓度；CL：表示溶质在下相溶剂中的浓度。

②分离难易与分离因子β：分离因子β值用来表示分离的难易。分离因子β定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。

即：β＝ KA / KB（注：KA＞KB）

一般，β≥100，仅做一次简单萃取就可实现基本分离；但100＞β≥10，则须萃取10～12次；β≤2时，要想实现基本分离，须做100次以上萃取才能完成；β≌ 1时，则KA ≌ KB，意味着两者性质极其相近，即使做任意次分配也无法实现分离。

③分配比与pH：对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统pH的影响。因为pH变化可以改变它们的存在状态（游离型或离解型），从而影响在溶剂系统中的分配比。以酸性物质（HA）为例，若使该酸性物质完全离解则pH≌pKa＋2；使该酸性物质完全游离，则pH ≌pKa－2。

一般pH＜3时，酸性物质多呈非离解状态（HA），碱性物质则呈离解状态（BH＋）存在；但pH＞12时，则酸性物质呈离解状态（A－），碱性物质则呈非离解状态（B）存在。

（2）液-液分配色谱：将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱。物质在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离的方法。

液-液分配柱色谱用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。

正相色谱与反相色谱：通常，分离水溶性或极性较大的成分，固定相多采用强极性溶剂，流动相则用弱极性有机溶剂，称之为正相色谱（极性固＞极性流）。如分离生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时，固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂。但当分离脂溶性化合物时，则两相可以颠倒，固定相可用石蜡油，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，故称之为反相分配色谱（极性流＞极性固）。

常用反相硅胶薄层色谱及柱色谱的填料系将普通硅胶经下列方式进行化学修饰，键合上长度不同的烃基（R）形成亲脂性表面而成。根据烃基（-R）长度分别命名为RP-2、RP-8及RP-18（2011，2012年）。

3．根据物质的吸附性差别进行分离 以固-液吸附用得最多，并有物理吸附、化学吸附及半化学吸附之分。

（1）物理吸附基本规律：相似者易于吸附。固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过程中的三要素。物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱及先后顺序都大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂，故有以下特点：①对极性物质具有较强的亲和能力，极性强的溶质将被优先吸附。②溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。③溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。

（2）溶剂极性及其强弱判断（2006，2008，2010，2011，2012年）：溶剂极性大体上与偶极矩极化度和介电常数相关，常用溶剂极性由弱到强顺序如下：己烷＜苯＜乙醚＜三氯甲烷＜乙酸乙酯＜乙醇＜甲醇＜水。

（3）活性炭（2010年）：为非极性吸附剂，与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。

（4）聚酰胺吸附色谱法（2011年）：属于氢键吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，极性物质与非极性物质均可适用，但特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。通常在含水溶剂中大致有下列规律：①形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。②成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附相应减弱。③分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。

各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，可大致排列成下列顺序：水→甲醇→丙酮→氢氧化钠水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液。

（5）大孔吸附树脂：是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料，它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。

大孔吸附树脂现在已被广泛应用于天然化合物的分离和富集工作中，如苷与糖类的分离、生物碱的精制。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的应用实例。

4．其他的分离方法

（1）凝胶滤过法（2010年）：主要用于分离分子量1000以下的化合物。也叫凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱，系利用分子筛分离物质的一种方法。①Sephadex G 型只适于在水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。②羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用（常用）。

（2）膜分离法（membrane separation technique）：是一种用天然或人工合成的膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯或富集的方法。

（3）离子交换法（2008年）：具有酸性、碱性及两性基团的分子，在水中多呈离解状态，据此可用离子交换法进行分离。离子交换法系以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而具有可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。根据被分离物质呈解离状态时所带电荷的性质，可选择阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。

鉴于中药所含大多数酸性、碱性或两性成分的酸碱性均较弱，一般在分离碱性成分时选择强酸性的阳离子交换树脂（2011，2012年），在分离酸性成分时选择强碱性的阴离子交换树脂。离子交换法亦可用于相同电荷离子的分离，其分离的依据是解离程度的不同（酸性或碱性不同的化合物，在相同条件下，其解离程度会有差异）。解离程度越大，被洗脱下来的速度越慢。

（4）分馏法：分馏法是利用中药中各成分沸点的差别进行提取分离的方法。液体混合物沸点相差100℃以上时，可用反复蒸馏法；如沸点差25℃以下，则用分馏柱，沸点相差越小，则需要的分馏装置越精细。