血管壁功能检验

（一）束臂试验

【原理】束臂试验又称毛细血管脆性试验（capillary fragility test，CFT）。通过给上臂加压，使局部静脉血流受阻，增加毛细血管负荷，检查一定范围内新出现的出血点数，来反映毛细血管的功能。

【操作】

1.前臂肘窝下4cm处画一个直径5cm的圆圈，用彩色笔标记圆圈内已有的出血点。

2.将血压计袖带束于测定臂，先测定血压，然后使压力维持在收缩压与舒张压（一般为90～100mmHg）之间，维持8min。

3.解除压力，待血液循环恢复2min后，计数圆圈中新的出血点。

【注意事项】

1.实验前先观察患者前臂有无出血点，若有出血点先做好标记，便于与新出血点区别。

2.40岁以上女性，病毒性感染（如流行性感冒等）、服用阿司匹林、活血化瘀药物时可出现毛细血管脆性增加。

【参考范围】圆圈内新的出血点数：男性<5个；女性和儿童<10个。

【临床意义】本试验阳性见于：毛细血管的结构、功能缺陷疾病，如遗传性出血性毛细血管扩张症、过敏性紫癜；血小板减少和功能异常；血管性血友病因子缺陷；其他如高血压、糖尿病等。

（二）出血时间测定

见《临床检验基础》

（三）血浆vWF检测

【原理】用双抗夹心ELISA法。纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被反应板，加入稀释的待测血浆，血浆中的抗原vWF:Ag结合于固相的抗体上，然后加入酶标抗人vWF:Ag抗体，与其定量结合，洗去多余酶标抗体后，加底物显色，在酶标仪上比色测定吸光度。通过查标准曲线，计算出vWF:Ag的含量。

【器材】37℃水浴箱、离心机、酶标测定仪、微量加样器等。

【试剂】血管性血友病因子抗原ELISA法测定试剂盒。

1.抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠。

2.缓冲液：0.1mol/L碳酸盐 （pH9.5）。

3.洗涤液：0.05%Tween-20，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）。

4.牛血清白蛋白（BSA）。

5.基质缓冲液：0.4%BSA-PBS。

6.单抗：兔抗人vWF：Ag抗体。

7.酶标单抗：辣根过氧化物酶标记的抗vWF单抗。

8.显色剂：OPD1mg/ml（用0.1ml/L，pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制），30%过氧化氢0.5μl/ml（临用前配制）。

9.终止剂：3mol/L硫酸。

10.正常人混合血浆。

11.ELISA包被板1块。

【操作】

1.制备贫血小板血浆　静脉采血1.8ml，用109mmol/L枸橼酸钠0.2ml抗凝（9:1），转速3000r/min离心10min，分离血浆备用。

2.包被　单克隆抗体用缓冲液稀释成10μg/ml后加入反应板中，每孔0.2ml，置于湿盒中4℃过夜。

3.加样　洗涤3次，加入基质缓冲液稀释的待测血浆，每孔0.2ml，37℃温育2h。

4.酶标　洗涤3次，加入用同上缓冲液稀释的酶标记vWF单抗，每孔0.2ml，37℃温育2h。

5.显色　洗涤5次后每孔加显色剂0.2ml。

6.终止　置室温约5min，各孔加终止剂 0.05ml终止反应。室温置10min，测定波长为492nm时的吸光度。

7.标准曲线制备　正常人混合血浆以0.4%BSA-PBS按1:20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。混合血浆六种稀释度的吸光度与其相对应的浓度在双对数坐标纸上绘制标准曲线。

8.计算　以正常混合血浆vWF浓度为100%或1U/ml。然后以标本吸光度值查找对应浓度（也可以线形回归方程计算浓度），结果乘以稀释倍数。

【注意事项】

1.对血浆vWF Ag含量过高的标本，超过线性范围，应稀释后测定。

2.重视ELISA法测定中应注意的事项。

【参考范围】（107.5±29.6）%。

【临床意义】

vWF：Ag浓度减低：主要见于血管性血友病（vWD），也是vWD诊断分型的重要指标。

vWF：Ag浓度增高：见于周围血管病变、心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、糖尿病、肾小球疾病、尿毒症、肺疾病、肝疾病、妊娠高血压综合征等。

（四）血浆内皮素-1（EF-1）检测

【原理】用双抗夹心ELISA法。将抗ET-1单克隆抗体包被固相载体，待检血浆中ET-1与固相包被的抗体结合，再加入酶标ET-1抗体，孵育洗涤后，加底物显色。根据吸光度的值即可推算出ET-1的浓度。

【操作】

1.贫血小板血浆制备：采静脉血2ml，注入含10%EDTA-Na23μl和抑肽酶40μl的试管中混匀。4℃，转速3000r/min离心10min，分离血浆备用。

2.包被、加样、酶标、显色、终止、标准曲线制作以说明书要求，参见血浆vWF检测。

3.计算患者血浆内皮素-1浓度，将其乘稀释倍数即为最后结果。

【注意事项】

1.空腹采血，避免溶血。

2.每次检测须做空白管。

3.标准品显色剂应在临用前配制。

4.样品-20℃可保存2个月，-70℃可存放6个月。测定前，样本置于室温后转速3000r/min离心5min，取上清液测定。

【参考范围】血浆中ET-l<5ng/L

【临床意义】血浆ET-1增高说明血管内皮细胞损伤，可见于心脑血管病变、原发性高血压病、高脂蛋白血症、肺动脉高压休克、肾衰竭及DIC等。

（五）血浆血栓调节蛋白（TM）检测

【原理】用双抗夹心ELISA法。用鼠抗人TM单克隆抗体包被于酶标板中，与待测血浆中TM结合后，孵育洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的抗TM抗体，形成鼠抗人TM抗体-TM-酶标抗TM抗体复合物。洗涤后加底物显色，根据显色程度，从标准曲线上查出TM含量。

【操作】

1.制备贫血小板血浆：静脉采血1.8ml，用0.109mol/L枸橼酸钠0.2ml抗凝，转速1500r/ min，离心10min，分离血浆备用。

2.包被、加样、酶标、显色、终止、标准曲线制作按说明书要求，参见血浆vWF检测。

3.计算：在标准曲线对应受检血浆TM值，结果乘以稀释倍数为受检标本的TM抗原量。

【注意事项】

1.分离血浆于室温下保存8h，-20℃可保存2个月，-80℃可保存6个月。冷冻标本复融时应置37℃水浴中进行，室温缓慢解冻会导致TM沉淀。

2.终止显色反应后，应于30min内读A值。空白管A值不得超过线性范围0.200。

3.如标本中TM含量超过标准曲线范围，应酌情增加稀释倍数。

【参考范围】20～35ng/ml。

【临床意义】TM是内皮细胞表面的跨膜糖蛋白，其含量增高是血管内皮损伤的一种标志物。增高见于急性心肌梗死、动脉粥样硬化、DIC、TTP、脑血栓、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、糖尿病、肾小球肾炎、闭塞性脉管炎、白血病、恶性肿瘤和严重肝病等。

（六）血浆6-酮-前列腺素F1α检测

【原理】用竞争ELISA法。将抗原（6-酮-PGF1α-牛血清白蛋白连接物）包被于反应板上，与血浆中6-酮-PGF1α（或标准品中6-酮-PGF1α）竞争性同加入的抗6-酮-PGF1α抗体结合。洗涤后加过量的酶标记第二抗体，孵育洗涤后加入底物显色。被检血浆或标准品中的6-酮-PGF1α的含量越高，反应板上6-酮-PGF1α与抗6-酮-PGFlα抗体结合就越少，结合酶标记第二抗体也越少，显色越浅，血浆6-酮-PGF1α含量与显色呈负相关，根据测定的吸光度，可从标准曲线中计算出被检血浆中6-酮-PGFα含量。

【试剂】

1.5%EDTA-Na2抗凝剂。

2.0.05mol／L碳酸盐缓冲液（pH9.6）。

3.0.41mol／L柠檬酸缓冲液（pH4.5）。

4.6-酮-PGF1α-牛血清白蛋白连接物（6-酮-PGFlα-BSA）。

5.6-酮-PGF1α标准品。

6.兔抗6-酮-PGF1αIgG。

7.羊抗兔IgC-辣根过氧化物酶连接物（酶标第二抗体）。

8.邻苯二胺。

9.30%过氧化氢。

10.聚山梨酯-20。

11.明胶（碳酸盐缓冲液配成0.3%浓度）。

12.3mol/L硫酸。

【操作】

1.制备血浆：静脉采血1.8ml，5%EDTA-Na20.2ml抗凝，转速3000r/min，离心20min分离血浆。

2.碳酸盐缓冲液将6-酮-PGF1α-BSA作一定稀释后包被于酶标反应板，再用0.3%明胶封闭。4℃过夜，洗涤3次，备用。加入标准品（倍比稀释成12.5～1600pg/ml 8个浓度和0pg/ml标准管）或待测样品、兔抗6-酮-PGF1αIgG各l00μl后在37℃中温育2h。洗涤5次后再加酶标第二抗体200μl，在37℃反应2h。洗涤5次，加邻苯二胺-过氧化氢溶液200μl，显色20min，加3mol/L硫酸50μl中止反应，在酶标检测仪上测定490nm处的吸光度A值。

3.计算

式中：B/B0为结合率。以标准品含量为横坐标，B/B0（%）为纵坐标，在半对数纸上做标准曲线。以样品孔B/B0（%）值在标准曲线上查出6-酮-PGF1α的含量。

【注意事项】

1.采血要顺利，尽快分离血浆，放-20℃以下3个月内稳定。

2.试验前10d停用阿司匹林类药物。

3.试管需要硅化处理或使用一次性塑料制品。

【参考范围】10.7～25.lpg/ml。

【临床意义】减低见于血栓性疾病、心肌梗死、脑血管病变、动脉粥样硬化、TTP、糖尿病、肿瘤转移、肾小球病变等。