大孔吸附树脂（macfofeticulaf resin）是20世纪60年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，它通过表面的电荷和形成氢键等作用具有较好的吸附性能，同时它具有多孔网状结构，根据具有的网孔大小而具有分子筛作用。大孔树脂提取技术的应用，使中草药有效成分单体或复方中某一成分的含量指标提高。目前，采用此技术对中药及其制剂中苷类、生物碱类、黄酮及内酯类等有效成分的提取与纯化都取得了一些满意的结果。本节应用D101大孔吸附树脂对猫爪草正丁醇提取部位进行纯化处理，在实验中参照文献研究，对大孔吸附树脂纯化过程的影响因素进行了考察，确定了大孔树脂纯化的最佳试验条件。
（一）主要仪器、材料及检测条件
1．仪器 GCMS－QP5050A气相色谱－质谱联用仪、配置离子源检测器和质量型检测器、DB－5石英毛细管柱、Chromatopac C－E1B数据处理机、KY－GC／MS－DS2数据系统、TU－1901紫外可见分光光度计、树脂色谱柱、中压液相色谱仪、柱层析预柱。
2．试剂与材料 二乙苯（95%）、萘、氯仿（为色谱纯）、D101型大孔吸附树脂、猫爪草正丁醇提取物（自制）、α－萘酚试液和三氯化铁试液。
3．色谱条件 色谱柱：DB－5石英毛细管柱（30m×0．25mm）；进样口：温度220℃，不分流；柱温：程序升温，35℃保持2min，再以5℃／min升温至70℃保持3min，继续以5℃／min升温至130℃后再以10℃／min升温至180℃。载气：氮气（≥99．999%），流量：1．5ml／min；进样量：1μl。
（二）方法与结果
1．大孔吸附树脂预处理方法的考察 商品树脂中有机残留物残留量很高，需经适当预处理，降低树脂中的有机残留物含量，方可安全地应用于药品和食品等生产中。
（1）大孔吸附树脂中有机残留物种类的确定：取适量D101型大孔吸附树脂装柱，加95%乙醇浸泡30min后开始洗脱，收集洗脱液，利用GC－MS技术对洗脱液进行检测分析。结果证实乙醇洗脱液中检测到的有机残留物有二乙苯和萘。
（2）两种对照品标准曲线与线性关系考察：分别称取二乙苯和萘对照品适量，加氯仿分别配制成2×10－6，4×10－6，6×10－6，8×10－6，10×10－6，分别吸取上述5个浓度的对照品溶液1μl，注入气相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录气相色谱图。以浓度为横坐标，峰高为纵坐标，作标准曲线。各对照品线性范围、回归方程及线性关系考察结果见表3－40。
表3－40 各对照品线性范围、回归方程及线性关系考察结果
（3）大孔吸附树脂的预处理：树脂的前处理及再生过程要求较严格，每次处理必须彻底，否则对有效成分提取的效果有较大影响。参考相关技术资料，进行如下的处理。称取一定量大孔吸附树脂，装柱（900ml／BV），加1．5BV 2%NaOH浸泡2h后洗脱，去离子水洗至pH中性，再在60℃，加95%乙醇浸泡1h后洗脱，洗脱流速为2BV／h，收集洗脱液，每0．5BV为1份，共洗脱3BV即可。
（4）树脂前处理结果的验证：精密称取0．2g未处理的树脂和1．0g经处理的树脂分别加入10ml量瓶中，精密加入5．0ml氯仿，称重，超声提取10min，再称重，补足减失重量，滤过，滤液注入气相色谱仪测定。结果未处理的树脂中苯系列有机残留物为二乙苯和萘，含量甚高，已处理树脂中萘含量甚微，二乙苯未检测到，结果见表3－41。
表3－41 树脂D101有机残留物含量测定结果（×10－6）
2．大孔树脂纯化的最佳实验条件
（1）最大吸附容量的确定：精密称取供试品一定量，加水至浓度为0．7g／ml，上预先处理好的大孔吸附树脂柱。待上样结束后，用400ml蒸馏水洗脱，流速为8ml／min，期间用α－萘酚试液和3%三氯化铁试液对洗脱液进行检视，逐渐增大上样量直至用水洗脱时显阳性反应，即有漏样现象，此时树脂的吸附达到了饱和，此上样量即为最大上样量，结果最大吸附容量为1∶25［正丁醇萃取物量：树脂（g）］。
（2）洗脱液的选择：精密吸取浓度为0．7g／ml的正丁醇萃取物一定量，上预先处理好的大孔吸附树脂柱，树脂柱依次用蒸馏水及30%，50%，70%，90%的乙醇梯度洗脱，每个浓度洗脱5个柱体积。一方面取一定量以干燥失重法测定浸膏含量；另一方面取一定量浓缩至适当体积后加入95%乙醇至不产生沉淀为止，过滤，滤液浓缩至干，用于测定皂苷含量。结果见表3－42。
表3－42 水及不同浓度乙醇洗脱效率的比较
由表3－42可得：从浸膏量分析，水洗脱效率最佳，占总浸膏53．51%；从皂苷量分析，30%乙醇洗脱效率最佳，占总皂苷量31．22%；从纯化率看，90%乙醇洗脱纯化率最好，占浸膏量的2．72%，70%乙醇次之，占1．51%。综合分析，30%乙醇洗脱皂苷量最大，纯度较高；水洗脱皂苷纯化率最低（0．16%），浸膏率最高（53．51%），除杂效果最好。
（3）洗脱液成分的鉴别试验
①理化鉴别：取两支试管，分别加入5ml 0．1mol／L HCl和0．1mol／L NaOH溶液，再各加3滴上述洗脱液（适当浓缩），振摇1min，碱液管呈淡棕色透亮，酸液管呈乳白色浑浊状。碱液管泡沫较酸液管持久，说明猫爪草中的皂苷主要为三萜皂苷。
②薄层鉴别：取人参皂苷和齐墩果酸为对照品，以氯仿∶甲醇∶水（65∶35∶10）下层为展开剂，展开，以10%硫酸乙醇为显色剂。3个紫色斑点几乎在一条直线上，也说明洗脱液主要为三萜皂苷。
③上样浓度的确定：精密称取供试品一定量，加水使浓度分别为0．5g／ml，0．7g／ml，1．0g／ml，1．5g／ml，2．0g／ml，分别上预先处理好的大孔吸附树脂柱，30%乙醇洗脱，以下操作同大孔树脂纯化的最佳实验条件，测定结果见表3－43。
表3－43 不同上样浓度对吸附效率的影响（n＝3）
上述结果表明上样浓度约为0．7g药材／ml时最佳。
（4）洗脱流速的选择：精密称取供试品一定量，4份，加入水使浓度0．7g／ml，分别上大孔树脂柱，以30%乙醇洗脱，使洗脱流速分别4ml／min，8ml／min，12ml／min，16ml／min，以下操作同大孔树脂纯化的最佳实验条件，测定结果见表3－44。
表3－44 洗脱流速对吸附效率的影响（n＝3）
试验结果表明，洗脱流速对结果具有影响，流速以12ml／min为宜。
（三）小结
1．通过上述实验研究证实，大孔树脂洗脱的最佳条件为：吸附容量为1∶25（正丁醇萃取物量∶大孔树脂），吸脱液以30%乙醇、50%乙醇对苷类洗脱较好；上样浓度为0．7g／ml，流速以12ml／min为宜。
2．该法脱糖效果好，且吸附容量大，适于工业生产，可作为植物药脱糖的理想方法。上样后，用水洗至Molish反应为阴性，将洗脱液浓缩至稠膏，冷冻干燥，即得棕褐色多糖。
3．大孔吸附树脂的预处理和再生方法。在树脂前处理时，先用5%HCl洗脱，后用纯化水洗至中性，再用2%NaOH洗脱，后用纯化水洗至中性，尔后用95%乙醇洗至流出液淡黄色，再用纯化水洗至流出液无醇味，即可再次使用。
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