色谱分析法

色谱分析法是检查有关物质的首选方法。

（一）薄层色谱法

薄层色谱法（以下简称TLC法）具有设备简单、操作简便、分离速度快、灵敏度和分辨率较高等优点。常用的方法如下：

1.杂质对照品法 适用于已知杂质并能制备得到杂质对照品的情况。

根据杂质限量，取供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液，分别点样于同一薄层板上，展开、斑点定位，将供试品溶液色谱中除主斑点外的其他斑点与相应杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液色谱中的主斑点进行比较，判断药物中杂质限量是否合格。

枸椽酸乙胺嗪中N-甲基哌嗪的检查以对照品N-甲基哌的甲醇溶液为对照品溶液（50 μg/ml），将供试品溶液（50 mg/ml）和对照品溶液分别点样于同一薄层板上，经展开、斑点定位，判断结果：供试品溶液若显与对照品相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液主斑点比较，不得更深（0.1%）。

盐酸环丙沙星中氟喹啉酸的检查，除了配制供试品溶液（10 mg/ml）和氟喹啉酸对照品溶液（30 μg/ml）外，还要配制两者的混合溶液，将这3种溶液分别点样于同一块硅胶G薄层板上，经展开和斑点定位，判断结果：混合溶液色谱中所显氟喹啉酸与环丙沙星的斑点应分离完全；供试品溶液若显与对照品溶液主斑点相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液主斑点比较，不得更深（0.3%）。

杂质对照品通常用来控制供试品中与之相同的杂质的限量，但有时也用来控制有关物质。如盐酸阿米洛利中有关物质的检查：以甲醇为溶剂配制供试品溶液（2 mg/ml）和3，5-二氨基-6-氯吡嗪-2-羧酸甲酷对照品溶液，浓度10 μg/ml为对照品溶液①，4μg/ml为对照品溶液②。将这3个溶液分别点样在同一块硅胶G薄层板上，经展开和紫外光灯（365 nm）下斑点定位，判断结果：供试品溶液若显与对照品溶液①的主斑点相应的杂质斑点，其荧光强度与对照品溶液①主斑点比较，不得更强；若显其他杂质斑点，与对照品溶液②主斑点比较，不得更强。再如盐酸纳洛酮中有关物质的检查：以甲醇为溶剂配制供试品溶液（8 μg/ml），和（-）-4，5α-环氧基-3，14-二羟基吗啡喃-6-酮对照品溶液（80 μg/ml），经展开和喷铁氰化钾-三氯化铁溶液显色进行斑点定位后，判断结果：供试品溶液若显杂质斑点，与对照品溶液所显的斑点比较，不得更深。

2.供试品溶液自身稀释对照法 适用于杂质的结构不能确定，或无杂质对照品的情况。该法仅限于杂质斑点的颜色与主成分斑点颜色相同或相近的情况下使用。

先配制一定浓度的供试品溶液，然后将供试品溶液按限量要求稀释至一定浓度作为对照品溶液，将供试品溶液和对照品溶液分别点样于同一薄层板上，展开、斑点显色、定位。结果判断：供试品溶液中所显杂质斑点与对照品溶液或系列自身稀释对照品溶液所显主斑点比较，不得更深。

消炎镇痛药吡罗昔康中有关物质的检查：取本品，加三氯甲烷制成每20 mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加三氯甲烷稀释成0.2 mg/ml的溶液，作为对照品溶液；吸取两种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇（25∶25∶5）为展开剂，展开，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品溶液若显杂质斑点，与对照品溶液所显的主斑点比较，不得更深。

3.杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用 当药物中存在多个杂质时，其中已知杂质有对照品时，采用杂质对照品法检查；共存的未知杂质或没有对照品的杂质，可采用供试品溶液自身稀释对照法检查。如硫酸奈替米星中有关物质的检查，制备三种浓度的对照品溶液：将浓度为150 mg/ml供试品溶液用水稀释成浓度为1.5 mg/ml的溶液作为标准溶液①，稀释成浓度为3 mg/ ml的溶液作为标准溶液②；取西梭米星对照品，加水制成1.44 mg/ml的溶液作为标准溶液③。经点样、展开、斑点定位后，判断结果：供试品溶液若显杂质斑点，其颜色与标准溶液③所显主斑点相比较，不得更深；其他杂质与标准溶液①所显主斑点相比较，均不得更深；若有一个斑点超过，应不深于标准溶液②的主斑点。

4.对照药物法 当无合适的杂质对照品，或者是供试品显示的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异，难以判断限量时，可用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。如马来酸麦角新碱中有关物质的检查，用马来酸麦角新碱样品配制成浓度为5 mg/ml的溶液①和0.2 mg/ml溶液②，同时，用马来酸麦角新碱对照品配制成浓度为5 mg/ml的溶液③，将这3个溶液分别点于同一硅胶板上，展开、斑点定位后，判断结果：溶液①主斑点的颜色与位置应与溶液③主斑点的颜色与位置一致，所显杂质斑点的颜色不得深于溶液③中对应的杂质斑点，并不得有溶液③以外的杂质斑点；溶液②除主斑点外，不得显任何杂质斑点。该法主要检查异麦角新碱、麦角酸、异麦角酸及其他麦角碱等杂质。马来酸麦角新碱对照品中所含的杂质是符合限量要求的，用它控制供试品中的一种杂质，而其他的杂质用溶液②控制。

为保证所用TLC系统符合要求，《中国药典》（2015年版）增加了TLC的系统适用性试验。

按各品种项下要求对检测方法进行系统适用性试验，使斑点的检测灵敏度、比移值（Rf）和分离效能符合规定。

（1）检测灵敏度：系指杂质检查时，采用对照品溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照品溶液在规定的色谱条件下，在同一块薄层板上点样、展开、检视，前者应显示清晰的斑点。

（2）比移值（Rf）：系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。

可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较，或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置。除另有规定外，比移值应为0.2～0.8。

（3）分离效能：鉴别时，在对照品与结构相似药物的对照品制成混合对照品溶液的色谱图中，应显示两个清晰分离的斑点。杂质检查的方法选择时，可将杂质对照品用供试品自身稀释对照品溶液溶解制成混合对照品溶液，也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照品溶液，还可采用供试品以适当的降解方法获得的溶液，上述溶液点样展开后的色谱图中，应显示两个清晰分离的斑点。

（二）高效液相色谱法

高效液相色谱法（以下简称HPLC法）。《中国药典》规定应按各品种项下要求，要进行色谱系统适用性试验，以保证仪器系统达到杂质检查要求。检测杂质有5种方法：

1.内标法加校正因子测定法 适用于有对照品的杂质，能够测定杂质校正因子的情况。先以杂质对照品测定其校正因子：

式中，As为内标物质的峰面积；AR为杂质对照品的峰面积；cs为内标物质的浓度；cR为杂质对照品的浓度。

2.外标法测定法 适用于有对照品的杂质，而且进样量能够精确控制（以定量环或自动进样器进样）的情况。

配制杂质对照品溶液和供试品溶液，分别取一定量注入色谱仪，测定对照品的峰面积和供试品中杂质的峰面积，按外标法计算杂质的浓度。

3.加校正因子的主成分自身对照测定法 进行杂质检查时，可以不用杂质对照品。但是在建立方法时，需利用杂质对照品。

将杂质对照品和药物对照品配制成一定浓度的溶液，进行色谱分离、分析后，按内标法求出杂质相对于主成分的校正因子：

式中，As为药物对照品的峰面积；AR为杂质对照品的峰面积；Cs为药物对照品的浓度；CR为杂质对照品的浓度。此校正因子可直接载入各品种质量标准中，在常规检验时用以校正该杂质的实测峰面积。

测定杂质含量时，将供试品溶液稀释成与杂质限量相当的溶液作为对照品溶液，进样，调节检测灵敏度，使对照品溶液的主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～25%。然后，分别进样供试品溶液和对照品溶液，除另有规定外，供试品溶液的分析时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图中各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照品溶液主成分的峰比较，计算杂质含量。

这个方法的优点是省去了杂质对照品，而又考虑到了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差。所以本法的准确度较好。缺点是在日常检验时没有杂质对照品，杂质的定位必须采用相对保留时间，所以杂质相对于药物的相对保留时间也载入各品种项下。

示例：红霉素A是红霉素的主要活性物质，红霉素B、 C是红霉素的杂质，其中红霉素C是主要杂质，毒性比红霉素A大2倍，活性仅为红霉素A的20%。《中国药典》（2015年版）采用此法检查红霉素B、 C组分及有关物质，供试品溶液的浓度为4 mg/ml，将供试品溶液稀释成浓度为0.2 mg/ml的溶液作为对照品溶液，用对照品溶液调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20 %，分别进样供试品溶液和对照品溶液，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。红霉素B峰和红霉素C峰校正后的峰面积（红霉素A、红霉素B、红霉素C的校正因子分别为1.0、 0.7、 1.0）均不得大于对照品溶液主峰面积（5.0%）。红霉素烯醇醚校正后的峰面积（红霉素烯醇醚的校正因子为0.09）不得大于对照品溶液主峰面积的3/5（3.0%）；其他单个杂质峰面积的和不得大于对照品溶液主峰面积（5.0%）。

4.不加校正因子的主成分自身对照测定法 适用于没有杂质对照品的情况。

以供试品溶液的稀释溶液为对照品溶液，调节检测灵敏度后，分别进样供试品溶液和对照品溶液，除另有规定外，供试品溶液的分析时间应为主成分色谱峰保留时间的2倍，供试品溶液中各杂质的峰面积与对照品溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。

该方法多在单一杂质含量较少、无法得到杂质对照品因而无法获得校正因子、杂质结构（吸收情况）与相应主药结构相似的情况下适用。前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同。一般情况下，若杂质与主成分的分子结构相似，其响应因子差别不会太大。否则，有可能导致定量有一定的误差。

5.面积归一化法 适用于粗略测量供试品中杂质的含量。

取供试品溶液适量，进样，经高效液相色谱分离、测定后，计算各杂质峰面积总和占总峰面积（含药物的峰面积，而不含溶剂峰面积）的百分率，不得超过限量。

该法简便快捷，但在杂质结构与主成分结构相差较大时可能会有较大的测量误差，因此在《中国药典》（2015年版）通则中特别强调：“本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查”，这就为本法的使用做出了明确的限制。

（三）气相色谱法

气相色谱法（以下简称GC法），用来测定药物中挥发性特殊杂质，特别是药物中的残留溶剂的检查。