抗体的结构

(一)抗体的基本结构

1.重链和轻链 天然抗体分子的基本结构包含两条相同的重链(heavy-chain,H)和两条相同的轻链(light-chain,L)。重链的分子量为50000～75000,含450～550个氨基酸残基;轻链的分子量约为25000,含约210个氨基酸残基。重链和轻链之间通过二硫键连接。同时链间存在诸如离子键、氢键以及疏水作用非共价相互作用,形成完整的抗体分子。链间二硫键的位置和数量随抗体的类别而异(图8-9)。

图8-9 IgG的构造

2.可变区和恒定区

(1)可变区:不同特异性抗体之间氨基酸序列的差异变化,集中于重链和轻链的近N端110个氨基酸。将这部分氨基酸序列高度变化的区域称为可变区(variable region,V),重链可变区标记为VH,轻链可变区标记为VL。抗体结合抗原的特异性,源自这些可变区氨基酸序列的差异。在VH和VL,各有3个区域的氨基酸组成序列和排列顺序高度变化,称为高变区(hypervariable region,HVR)或互补决定区(complementarity determining region, CDR),因为这些部位构成是抗原表位的结合部位(antigen binding site),与抗原空间构象互补。分别用CDR1(HVR1)、CDR2(HVR2)和CDR3(HVR3)表示。V区中HVR以外区域的氨基酸序列组成和排列顺序相对变化不大,称为骨架区(framework region,FR)。VH和VL各含有3个CDR和4个FR。

(2)恒定区:相对于可变区而言,靠近肽链C端的氨基酸序列相对恒定,变化较少,称为恒定区(constant region,C)。重链和轻链的恒定区,分别标记为CH和CL。根据重链恒定区的差异分为5种类型,即μ、γ、α、δ和ε,决定了5种抗体类别:IgM(μ)、IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)和IgE(ε)(图8-10)。根据重链γ链和α链恒定区的一些微小差异,人类中有α1 (IgA1)和α2(IgA2),以及γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)不同亚类。识别不同抗原的同一类别抗体,V区不同,而C区氨基酸序列组成基本相同,免疫原性相同。同样,根据轻链恒定区的差异,分为κ和λ两型。在人类中,60%的轻链是κ(kappa)型, λ(lambda)型占40%。在小鼠中,高达95%的轻链是κ型,而只有5%的轻链是λ型。一个天然抗体分子的轻链同型,重链同类。

λ型轻链间氨基酸序列差异很小,通常用作亚型的鉴别。小鼠中有3种亚型,而人则有4种亚型。抗体是糖蛋白,连接糖基团的位点一般位于恒定区。目前对抗体上糖基团所起的作用还未充分了解,已知的是糖基团增加了抗体的可溶性。糖基团的缺失或者是在错误位置上糖基化将会影响抗体与Fc受体等分子的相互作用。

图8-10 IgM、IgG、IgA、IgD以及IgE的基本结构

3.球状结构域 Ig分子的每条肽链可折叠成2～5个球状结构域(domain)或功能区。每个结构域约含110个氨基酸,经肽链折叠形成反向平行的β片层,链内二硫键连接构成稳定的“β”桶状结构,再进一步折叠成球状结构。相邻的球状结构域相互作用即组成蛋白质的四级结构。Ig轻链含有一个VL结构域和一个CL结构域;重链含一个VH结构域。根据抗体类别不同,IgG(γ)、IgA(α)和IgD(δ)重链恒定区有3个结构域(CH1、CH2和CH3),而IgE (ε)和IgM(μ)重链恒定区有4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。抗体单体含有2个抗原结合部位,一对VH和VL结构域共同构成抗体的一个抗原结合部位。恒定区因各个结构域的氨基酸序列组成特点,与多种分子、细胞表面受体相互作用,参与多种多样的生物学功能(详见“抗体功能”)。

4.铰链区 铰链区(hinge region)位于γ、α和δ重链的CH1和CH2之间。铰链区多肽序列富含脯氨酸和半胱氨酸,因此易弯曲和伸展,使抗体可以灵活调整其两个抗原结合部位间的距离,以利于同时结合两个抗原分子。这种现象通过电镜下观察抗原抗体复合物可以见到。不同类或亚类的Ig铰链区不尽相同,长度从10个到超过60个氨基酸不等。铰链区也是不同IgG亚类恒定区之间差异的主要部位,这也从整体上造就了IgG亚类不同的构型。μ和ε链上没有铰链区。

(二)抗体的辅助成分

1.J链 J链(joining chain)富含半胱氨酸,由浆细胞合成,连接单体IgA和IgM,分别形成二聚体IgA和五聚体IgM。5个单体IgM在重链羧基端Cμ4/Cμ4结构域和Cμ3/Cμ3结构域,经二硫键彼此连接在一起,并通过二硫键与J链连接成五聚体。

2.分泌片(secretory piece,SP)分泌片是多聚免疫球蛋白受体(poly-Ig receptor,pIgR)胞外段的4个结构域,由黏膜上皮细胞合成。新合成的IgA二聚体与黏膜上皮细胞基底外侧pIgR结合后,通过细胞内吞一起进入胞质,进一步通过酶和胞吐作用,将结合分泌片的IgA转运到黏膜表面,成为分泌型IgA(SIgA)。分泌片具有保护SIgA的铰链区,免于蛋白水解酶降解的作用。IgM五聚体也可以通过这种方式转运到黏膜表面。

(三)解析IgG抗体多链结构的经典实验

血清中IgG抗体的分子量大约为150000。IgG结构通过以下实验得以阐明。

1.蛋白酶水解实验 铰链区富含脯氨酸和半胱氨酸,使其容易被蛋白水解酶如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解为各种片段。

(1)木瓜蛋白酶水解:用木瓜蛋白酶(papain)消化IgG,因其作用部位在铰链区链间二硫键连接的两条重链近N端,会产生3个片段(图8-1)。其中的两个片段完全相同,分子量约45000,称为Fab片段(fragment of antigen binding,Fab)。Fab由重链的VH和CH1结构域,以及一条完整的轻链(VL和CL)组成,只能结合单个抗原表位。第三个片段分子量约50000,因冷却时会出现结晶,称为Fc段(fragment crystallizable,Fc)。Fc段由一对CH2和CH3结构域组成,不具抗原结合活性,却是抗体与补体和细胞表面Fc受体(FcR)相互作用的部位。

(2)胃蛋白酶水解片段:用胃蛋白酶(pepsin)消化IgG,因其作用部位在铰链区链间二硫键连接的两条重链近C端,产生一个分子量100000的F(ab')2片段和一些小片段。F(ab')2片段由2个Fab和铰链区组成,含有两个抗原结合位点。

2.巯基乙醇还原实验 IgG包含两条相同重链和两条相同轻链,链间经二硫键连接。通过巯基乙醇可以还原和烷基化单体重链或者轻链,将IgG肽链内和肽链间二硫键不可逆地打断;然后,根据分子大小过柱层析,发现IgG具有分子量50000的重链和25000的轻链。

(四)免疫球蛋白上的抗原决定簇

抗体属于糖蛋白,它们本身可以作为免疫原来诱导抗体反应。在免疫球蛋白分子上的抗原决定簇或表位可分为3类:同种型(isotypic determinant),同种异型(allotypic determinant)以及独特型(idiotypic determinant)。

1.同种型(isotype) 同种型抗原表位位于同种抗体的恒定区,可刺激异种动物产生针对该抗体的免疫应答,是种属标记。

2.同种异型(allotype) 同种异型表位位于同一种属的不同个体来源抗体的恒定区,可刺激不同个体产生针对该抗体的免疫应答,是个体遗传标记。

虽然同一种属遗传相同一套的同种型基因,但个体间有等位基因的存在,编码1～4个氨基酸序列的差异是同种异型抗原决定簇存在的基础。IgA2有两种亚型:A2m(1)和A2m(2)。κ轻链有3种同种异型抗原决定簇:κm(1)、κm(2)以及κm(3)。如Balb/c与C57BL/6小鼠来源的IgG有不同的同种异型。

3.独特型(idiotype,Id) 独特型表位存在于同一个体来源的抗体分子的可变区。抗体VH和VL独特的氨基酸序列,不仅是抗原结合位点,也是构成独特型表位的基础。独特型在异种、同种异体和同一个体内均可刺激产生抗独特型抗体。体内产生抗独特型抗体的前提条件是某个抗原特异性B细胞克隆经抗原激活后,大量扩增致该独特型超过免疫系统感知的阈值。