游离标记和结合标记药物的分离技术

放射性免疫分析属于非均相免疫分析，因此测定必须将游离标记药物F和结合标记药物B分离。此分离过程是影响分析结果好坏成败的关键。常用的分离方法有沉淀法、双抗体法、吸附法等，下面将进行一一介绍。

1.吸附法

吸附法适用于绝大多数RIA中F和B的分离，其原理是利用固体吸附剂能吸附反应液中的游离抗原从而使F与B分离。活性炭是常见的吸附剂，但是它对于F和B均能吸附，但是将其经右旋糖酐或者葡聚糖处理后，具有了表面分子筛的作用，使得小分子的游离药物能透过分子筛网眼被活性炭选择性吸附，而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中。待吸附达平衡后离心，上清液中即得到与抗体相结合的标记药物(B)，而沉淀中则是游离的标记药物(F)，从而实现F和B的分离。

值得注意的是，分离过程需在4℃时进行，否则抗原抗体复合物可能在活性炭的强力吸附作用下解离而呈现游离状态，影响结果测定。

2.化学试剂沉淀法

该法的原理是利用蛋白沉淀剂将抗体沉淀，从而使与抗体相结合的药物也一起沉淀下来，游离的药物则留在溶液中。常用的沉淀剂有一些酸性盐类(如硫酸铵、亚硫酸氢钠)和有机试剂(如乙醇、异丙醇、PEG等)。其中硫酸铵和PEG是最常见的沉淀试剂。与吸附法正好相反，该法所得的标记药物－抗体结合物存在沉淀中，处理过程同样需在低温4℃下进行。

化学试剂沉淀法的优点是价廉和快速;缺点是难以使F和B完全分离，且沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附，故而测定结果的准确度较低。

3.双抗体法

双抗体法又叫免疫沉淀法(immuno－precipitation method)，分离原理是药物与抗体结合后形成的抗原－抗体复合物(第一抗体)在反应液中处于溶解状态，向该反应体系中投入另一种免疫球蛋白可获得分子量大到足以沉淀的第二抗体，通过离心等手段可实现F和B的分离。第二抗体通常是将第一抗体作为新的抗原注入牛、羊、马等较大动物，发生免疫反应后制得。该法的优点是特异性好，重现性好;缺点是第二抗体的制备有一定难度，且操作时间较长。

4.固相分离法

固相分离法的原理是先将抗体通过物理吸附或者共价结合的方式结合在不溶性固相载体表面，待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上形成抗原－抗体复合物，而游离的抗原(F)则仍留在反应液中，继而通过离心等方式实现两者分离。常用的固相载体有葡聚糖凝胶、塑料、聚苯乙烯、纤维素、皂土等。图7－6所示为单层竞争性固相法的反应原理。

固相分离法的优点是操作简便、易实现自动化分析;缺点是由于固相载体也会少量吸附游离标记药物，导致测定结果误差增大。

图7－6　单层竞争性固相法原理示意图

除上述介绍的4种常用F和B的分离技术外，尚有葡萄球菌A蛋白分离法(SPA分离法)、微孔滤膜法(Millipore filtermethod)等分离技术，这里就不再一一介绍了。