免疫分析的基本原理

免疫分析检测的基本原理是抗原－抗体之间的特异性结合反应。传统的免疫分析法又称非标记免疫分析法(non－labeled immunoassay)，主要是利用抗原抗体反应后理化性质的变化对抗原抗体进行测定的方法，测定手段包括免疫扩散(immunodiffusion)和免疫电泳(immunoelectrophoresis)等。免疫扩散是可溶性的抗原和相应的抗体在溶液或凝胶中彼此接触，形成不溶性抗原－抗体复合物沉淀。免疫电泳技术是将免疫扩散与电泳技术相结合的分析手段。非标记免疫分析需要抗原与抗体结合形成大分子沉淀，以此进行定性和定量分析。沉淀反应并不是那么普遍，通常抗原和抗体之间的结合反应难以用肉眼观察，此外非标记免疫分析灵敏度不高，因此其应用受到限制。随后，科学家们向反应体系中加入特定的标记物来帮助显示结果，而这些标记物的存在并不会改变抗原抗体结合的特异性。这种利用标记物的辅助作用实现免疫分析目的分析方法叫做标记免疫分析法。标记物的加入使得测定的灵敏度极大提高，同时检测的方法和类型也有了更多的变化。在当前的各种免疫技术中，标记免疫分析是最为活跃的、发展最快的一个领域，因此本章所介绍的免疫分析均为标记免疫分析技术。标记免疫分析技术基本原理是采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原－抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物进行测定，达到对免疫反应进行监测的目的。

尽管标记免疫分析种类繁多，但其反应过程均可概括归纳为“4个环节”和“3种方式”。

通常认为标记免疫反应的4个环节为:①抗体生产;②标记试剂的制备;③分析方式的设计;④分析信号的检测。4个环节丝丝入扣，其中最关键的环节是标记试剂的制备，它决定了选择何种分析方式以及采用何种检测方式，以及检测的灵敏度、精密度、准确性等。

3种方式指的是:①非竞争方式(标记抗体);②标记抗体的竞争方式;③标记抗原的竞争抑制方式。反应式可以表示如下:

其中，Ag代表未标记抗原，Ag*代表标记抗原，Ab代表抗体，Ab*代表标记抗体。非竞争方式通过形成“Ab0－Ag－Ab*”式的夹心式化合物检测多价性抗原，故常被形象地称作“双夹心”法。该法适用于检测分子中具有2个或2个以上抗原决定簇的多价抗原，而不适合于小分子半抗原的检测。

非均相免疫分析方法可以采用以上3种方式中的任何一种，但是均相免疫分析的原理多为标记抗原的竞争方式。由于标记抗体的分析方法在实际操作中有许多难点，因而目前鲜有报道用于免疫分析中。

一般的免疫分析体系即是采用标记抗原的竞争抑制方式。所谓竞争抑制原理，就是当某一反应体系中存在一定量的特异抗体时，标记后的抗原Ag*(标记药物)和未标记的抗原Ag(未标记药物)会与有限量特异性抗体(Ab)发生竞争性结合。其反应原理可以参考图7－1。其中B表示标记抗原－抗体结合物，F表示游离的标记抗原。由图7－1可见，标记的抗原－抗体结合率(B%)与未标记抗原Ag(未标记药物)量呈负相关，原因是未标记抗原抑制了标记抗原和抗体的结合，也可以说标记抗原被未标记抗原所稀释，使其和抗体发生结合的几率变小。故可以通过测定标记的抗原－抗体结合物，得到待测药物的量。这种竞争性抑制数量关系是免疫分析的定量基础。B%的计算公式为B%=B/(B+F)×100%。

图7－1　竞争抑制原理示意图

在测定样品时，一般先配成系列浓度的标准溶液，然后加入一定浓度的标记抗原Ag*和抗体Ab。待反应达到平衡后，用上述公式计算结合率(B%)，并可以以标准抗原的浓度为横坐标，以结合率(B%)为纵坐标绘制标准曲线，后根据标准曲线得到相应待测药物的含量。