胆道肿瘤的基因诊断

（一）胆道肿瘤中染色体畸变的检测及意义

20世纪初染色体平衡失调是肿瘤病因的假说，其后随着免疫组织化学技术和分子生物学方法的发展和改进已证明绝大多数肿瘤细胞都会出现染色体非随机性改变，常伴有染色体数目的异常及结构的畸变，而这些异常又是肿瘤发生中癌基因和抑癌基因异常表达的细胞学基础。最常见为染色体数目的非整倍改变，染色体畸变则以易位、重排、缺失和插入等多见。一般而言，分化好的肿瘤细胞的染色体数接近二倍体，而恶性程度高的肿瘤的染色体则变动较大，多数肿瘤的倍性与其恶性程度、转移及预后相关。

1.染色体数目异常　研究证实约90%以上恶性肿瘤的染色体为非整性，大多呈超二位体，也有呈亚二位体，较常见的是8、9、12和21号染色体的增多或7、22号和X染色体的减少。Storto在分析二株胆管癌细胞株染色体变化时发现，二株细胞染色体均为非整倍体，染色体数目平均为66条，在2、5、11及20上有三染色体。本实验胆管癌瘤细胞染色体数目平均为62.3条，以三倍体和超二倍体多见。

2.染色体结构异常　在56种人类肿瘤中以发现3　152种染色体结构异常，包括易位、缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体等，其中部分为特异标记染色体。Kim用荧光原位杂交（FISH）技术分析四株胆管癌细胞系发现染色体3、6、7、8、9、12、14、17和18是常见的结构异常部位。Rijken用比较基因组杂交（CGH）方法分析14例胆管癌病人发现扩增部分是8q、20q、12p、17q、Xp、2q、6p、7p、11q、13q、19q，缺失部分是18q、6q、10p、8p、12q、17p。Kawaki、Ahrendt、Ding等对胆管癌杂合性缺失（LOH）的研究分别发现，8p22、9p21、5q35存在高频率缺失。Kim DG等用多种染色体涂染探针的FISH技术对所建立的四株胆管癌细胞系SCK、JCK、Cho－CK、Choi－CK进行细胞遗传学分析、发现各自染色体核型的特征性改变，染色体3、6、7、8、12、14、17和18是常见的结构异常，在SCK和JCK中发现同源染色部位，在Cho－CK中发现双微体。Fujii显微切割肝细胞癌和肝内胆管癌的复合癌病灶11例，对1p、1q、3p、4q、5q、6q、8p、9p、10q、11q、13q、16q、17p、17q、18q、22q进行等位分析，杂合性缺失4q、17p、8p、16。Kang YK用55个基因组微卫星探针对36例肝内胆管癌进行连锁分析发现，杂合性缺失频率为：8p（65.6%）、17p（64.7%）、9p（64.5%）、18q（54.2%）、1p（48.5%）、3p（44.8%）、9q （42.1%）、14q（41.7%）、6q（41.7%）、1q（40.6%）。抑癌基因p16在多种肿瘤中失活，Ahrendt SA用微卫星分析技术检查10例胆管癌，9例（90%）有9p21的纯合性缺失，用免疫组化和PCR技术检测7例，4例（57%）p16基因失活。Kawaki等实验观察8p22的杂合性缺失及其相关抑癌基因：ABC、DCC、HNPCC、RBI、p53的失活。Rijkery用细胞遗传学和比较基因组（CGH）方法分析14例胆管癌病人发现有11条染色体部分和整臂扩增，9条染色体部分和整臂缺失，缺失的有：18q（8/14）、6q、10p（7/14）、8p、12q、17p（6/14）、7q、12p、22q（4/14）；扩增的有：8q、20q（6/14）、12p、17q、Xp（5/14）、2q、6p、7p、11q、13q、19q（4/14），这种改变与他们先前报道胰腺癌改变相似。

（二）胆道肿瘤中癌基因的检测及意义

人体细胞的原癌基因在正常情况下呈低水平表达，参与调节和维持正常细胞的功能，但当受到各种因素激活后，被激活的癌基因大量表达，产生特异性转化蛋白，最终导致正常细胞的癌变。

1.ras癌基因　ras基因族的成员有K－ras、H－ras及N－ras，它们编码21kD蛋白质，与G蛋白有关，具有GTP酶活性，参与从细胞膜酪氨酸激酶传递信号给细胞质的丝氨酸－苏氨酸激酶，转而将这些信号传递给细胞核。ras基因产物可受自发性或化学性致癌的单点突变而激活，一个氨基酸的被置换已足以激活有恶性潜能的ras蛋白，导致表型的恶性表现。ras基因的突变通常发生在第12、13或61密码子。胆道肿瘤主要为K－ras基因第12密码子点突变，其突变率相差很大。中国台湾地区学者Lee等报道，胆管癌中K－ras基因的突变率为33%，均为第12密码子G－A的突变，使甘氨酸（GGT）变成了天门冬氨酸（GAT），其突变率高于泰国（8%）而低于日本（60%）。甘氨酸对ras蛋白的正常功能如果被其他氨基酸（脯氨酸除外）替代，则可导致癌基因的激活。Matsubara等用PCR－SSCP法研究了胰胆管异常汇合（pancreatico－biliary maljunction）病人癌性及非癌性胆管上皮细胞中K－ras基因点突变，发现癌性上皮细胞K－ras基因点突变率为80%，而增生上皮和化生上皮分别为58%及48%，其突变部分为第12密码子，突变方式与Lee等所述相同，提示K－ras基因点突变在胆管癌形成过程中起重要作用。Ohashi等分析14例肝内胆管癌及9例肝外胆管癌K－ras基因点突变，发现肝内胆管癌第12密码子突变率为50%，肝外胆管癌为67%，除1例胆管癌为第二碱基G－T替代外，其余均为G－A的替代，第13及61位密码子未发现突变。同时还发现K－ras基因点突变与病人年龄、肿瘤分期、组织学改变及预后均无明显关系。而Malats等则报道，肝外胆管癌K－ras基因第12密码子的点突变率为41%，突变与临床及病理特征无关，但与病人的预后有关，有突变者平均生存1.7个月，无突变者平均生存7.7个月，在Ⅰ、Ⅱ期肿瘤中，突变者的死亡概率较无突变者高7.8倍。研究结果不尽一致的原因可能与地理环境、检测样本量、检测方法等不同有关。

Ras基因的产物p12蛋白，分子量为21kD，位于细胞膜内侧面，具有GTPase活性。ras基因突变后，p12所具有GTP分解活性降低，使其信息传递系统不能有效启动而导致细胞的自主性增殖。Lee等发现胆总管肿瘤中p12蛋白阳性表达率为50%，其表达与p53表达之间无明显关系。

2.HER－2/neu癌基因　HER－2/neu基因（HER－2又称为C－erbB－2）定位与染色体17q21上，是正常细胞中的一种原癌基因，编码分子量为185kD、与表皮生长因子受体（EGFR）高度同源的、具有酪氨酸激酶活性在跨膜蛋白（p185）。在人类肿瘤中，由于HER－2/neu基因的扩增与过度表达，可使其成为具有转化细胞能力的癌基因。C－erbB－2在多种人类肿瘤中均有显著表达（如乳癌、胃癌等）。Chow等报道，C－erbB－2p185蛋白在27.8%的肝内胆管癌中有过度表达，但p185过表达与胆管癌的分期、分级无关。Motojima等则指出，p185蛋白在胆管癌组织中具有较高的表达率（68%），并与肿瘤分期及生存时间相联系，p185蛋白阳性者生存时间短，可作为判断胆管癌预后的指标。Sirica等分析了诱导鼠胆管癌发生过程中neu基因及neu mRNA表达情况，发现胆管癌组织中p185蛋白及neu mRNA均有较强的表达，而在不典型增生上皮中则表达较弱，表明HER－2/neu基因的扩增与过度表达可能在胆管癌的发生过程中起重要作用。

3.c－myc癌基因　c－myc基因定位于8号染色体上，编码p62核内蛋白。在细胞静止期c－myc几乎不表达，但在有丝分裂原刺激下可迅速表达，促使细胞从G0期进入G1期，当与其他活化癌基因（如ras基因）协同作用时，可导致细胞的恶性转化，在多种癌基因共同操纵细胞癌变过程中，c－myc癌基因能使细胞无限增殖。C－myc癌基因的阳性表达率高达94%，且阳性率与肿瘤分化程度密切相关，高分化肿瘤阳性率为100%，而低分化肿瘤为72%。

4.c－met癌基因　c－met基因编码肝细胞生长因子受体，为异二聚体的酪氨酸激酶膜蛋白。c－met在多数消化道肿瘤中有较高的表达，对其在胆管癌中表达情况的研究极少。近来，Terada等报道c－met在增生胆管上皮中的阳性表达率为81%，在胆管癌中的阳性表达率为58%，并发现高分化癌的阳性染色强度明显高于低分化浸润癌，说明c－met基因的过表达为胆管癌发生的早期事件，在胆管癌的进一步发展中不一定起作用。

（三）胆道肿瘤中抑癌基因的检测及意义

抑癌基因改变在肿瘤形成中的作用，即所谓“隐性机制（recessive mechanism）”引起了人们的广泛兴趣，已经证明抑癌基因的缺失或突变也导致细胞恶变。

1.p53抑癌基因　p53基因定位于人17号染色体短臂上，即17p13.1。正常的p53基因是肿瘤抑制基因，在细胞中调节生长与分化，p53基因突变为人类肿瘤中发生最频繁的抑癌基因改变，对细胞周期的调节起重要作用。Yoshida等在2株胆管癌及2株胆囊癌细胞株中各发生1株有p53基因的突变，在4例肝门部胆管癌中亦发现1例有p53基因突变，说明胆管癌中存在p53基因的突变。Kiba等分析了38例日本和泰国的肝内胆管癌标本，发现p53突变率：日本为33%，泰国为35%，除1例外，p53基因的突变均发生在高度保守区域，主要是在CGP位点由G：C－A：T转化。Head等进一步证实在胆道癌细胞中的p53基因第272－282密码子存在错义、插入及缺失突变。

p53蛋白的过度表达与p53基因的突变是一致的。p53蛋白在胆管癌中的阳性表达率为38%～55.6%。Diamantis等提出，肝外胆管癌p53蛋白的阳性表达率以中下段癌为高，其阳性表达率与病人预后及肿瘤分期有明显关系，p53蛋白阳性者平均生存期为5.2个月，阴性者为25.7个月，5例Ⅰ期肿瘤p53均为阴性，而在12例Ⅱ期肿瘤中有9例p53阴性。最近，Suto等的研究则表明胆管癌组织中p53蛋白的阳性表达与肿瘤分期、淋巴结转移、神经周围浸润及预后等无明显关系。

2.p16抑癌基因　p16基因定位于9号染色体短臂（9p21），编码一种环素依赖激酶4抑制蛋白（CDK4），为一种细胞周期调节蛋白，抑制细胞从G1到S期。已经发现食管癌、胰腺癌中有较高的p16基因突变和缺失。Yoshida等对25例胆道原发癌和4株胆道癌细胞株进行分析，发现2株胆道癌细胞株有p16的纯合性缺失，在原发癌中p16的点突变率为63%，明显高于p53及K－ras基因突变，说明p16基因突变是胆管癌发生发展的一个重要因素。最近，Imai等报道，p16基因在壶腹癌中的突变率为41.2%，较其他类型肿瘤高，认为p16在胰胆管癌中相对高的突变率提示胆汁或胰液中可能存在一种目前尚不知道的诱癌因素。

3.p15抑癌基因　p15是p16的相邻基因，编码CDK4的同源蛋白MTSZ，同属CDK4家族。Yoshida等发现2株胆囊癌及2株胆管癌细胞株中均有p15基因的纯合性缺失，而25例胆道原发癌中未发现p15在第2外显子处有点突变，因未做进一步的缺失分析，故对p15在胆管癌发生中的作用尚不能确定，有待进一步的研究。

4.DPC4/Smad抑癌基因　DPC4基因定位于18号染色体（18q21.1），为Smad蛋白家族成员，参与转化因子β（TGFβ）的信号传导。Hahn等报道，在超过50%的胰腺癌中有DPC4基因的纯合性缺失或点突变，并发现1例来源于原发胆管癌的异种移植肿瘤中有DPC4基因的纯合性缺失，进一步用PCR－SSCP法分析了32例胆管癌（其中胆总管癌为8例），发现16%有DPC4点突变，其中胆总管癌的突变率为50%，提示DPC4基因突变可能在胆总管癌的发生发展中起重要作用。

胆道肿瘤基因诊断的问题及展望：肿瘤的发生发展是由多种遗传改变的累积造成的，遗传改变包括原癌基因的激活及肿瘤抑制基因的失活等。肿瘤的发生往往是由数个癌基因或原癌基因共同参与的复杂过程。胆管癌的遗传学研究虽然取得了一定的进展，上述研究结果表明胆管癌中有癌基因ras、HER－2/neu、c－myc、c－met及抑癌基因p53、p16、p15、DPC4的突变、缺失或过表达，但仍有许多问题尚待解决。目前大多数研究为小样本的比较研究，研究材料及方法也不尽相同，导致各项研究结果不尽一致，甚至相互矛盾。许多新的分子生物学技术和许多与肿瘤有关的基因功能团尚未用于胆管癌的研究，各种癌基因在胆管癌发生中的相互作用、协调关系尚不清楚。此外，对胆管癌癌前病变遗传学改变的研究甚少。要真正阐明胆管癌发生机制及抑制其发展，还需要做大量的工作。近来，Claymam等已在实验中成功地导入Rb和p53基因，使肿瘤细胞发生了逆转，为今后基因治疗的开展奠定了基础。相信随着对肿瘤细胞、分子遗传学研究的不断深入，必将能揭示胆管癌发生发展的规律，为胆管癌的早期诊断及有效防治提供有力的武器。

（高　戈）