糖化血红蛋白的检测方法

目前,糖化血红蛋白(Hb A1c)作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效考核的有效检测指标,在临床中得到了广泛的使用。

目前,HPLC法测定Hb A1c使其准确性和重复性得到很大的提高。美国临床化学协会(AACC)糖化血红蛋白标准化分会和IFCC Hb A1C标准化工作组建议,以美国1型糖尿病控制及并发症实验(DCCT)研究中所“指定的方法”-HPLC方法作为检测糖化血红蛋白的金标准,希望以此使大多数的试验方法能够参照“指定的方法”实现标准化。

1993年美国1型糖尿病控制及并发症实验和英国大规模的2型糖尿病控制与并发症关系研究(UKPDS)的研究中把Hb A1c作为糖尿病控制的一个观察指标。1996年4月起在日本,Hb A1c被纳入老年人保健法中糖尿病筛选的检查项目。2002年美国糖尿病协会(ADA)已将其作为监测糖尿病控制的金标准,对其应用也作了明确的规定,即所有糖尿病患者均应常规测定Hb A1c。其初诊时测定结果为基线时的代谢状况,此后的测定值则作为糖尿病长期治疗控制中的一部分,这样在提高糖尿病诊断水平、血糖控制、慢性并发症的防治中具有十分重要的应用价值。

一、检测Hb A1c的临床意义有以下3点。

1.在糖尿病的筛选普查中有早期提示的价值,可作为轻症、2型、“隐性”糖尿病的早期诊断指标。

2.在糖尿病的治疗中,Hb A1c是评价血糖控制好坏的重要标准。

3.预示微、小血管并发症,评估糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。

二、简 介

正常血红蛋白有3种:血红蛋白A(Hb A),血红蛋白F(Hb F),血红蛋白A 2(Hb A 2),成年人红细胞中主要含有Hb A。在用层析法分离血红蛋白时,可洗脱出3种含糖成分即:Hb A1a, Hb A1b和Hb A1c,合称为糖化血红蛋白。

Hb A1c是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。血糖通过弥散方式进入细胞内,无须胰岛素参与。血糖与血红蛋白的结合过程缓慢且不可逆,在红细胞死亡之前一直存在,故体内衰老红细胞比新生红细胞的糖化血红蛋白含量约高出1.5倍。每一个红细胞内都有血红蛋白,而红细胞的寿命为120d,平均60d,所以糖化血红蛋白比例能反应测定前1～2个月的平均血糖水平。

糖化血红蛋白越高表示血糖与血红蛋白结合越多,糖尿病病情也越重。它避免了每日的血糖值的波动,与病人采血时间、是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。当糖尿病控制较好时其浓度在一定值范围,如糖尿病控制不佳时其浓度可高至正常的2倍以上。因此,成为糖尿病治疗过程中疗效监测的重要手段。Hb A1c检测用于常规实验室始于20世纪70年代末期,且稳定发展至今,检查糖化血红蛋白已成为了解糖尿病控制良好与否的重要指标。国外已将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的金指标。

目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类:一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子层析法、电泳等方法;另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中高效液相离子层析法(HPLC)被公认为金标法。

三、糖化血红蛋白的几种不同检测方法

测定GHb主要是利用GHb和Hb的物理化学性质的不同而进行的,目前主要的检测方法有以下几种。

1.离子交换高效液相色谱分析法-检测糖化血红蛋白Hb A1c的金标准 基于Hbb链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。在中性p H条件下,Hb A1c携带的正电荷相对较少,因此,可通过HPLC法将其与其他组分(Hb A1c,Hb A1b,Hb A1a,Hb F,Hb Ao)区分开,得到分离。此方法曾应用于美国DCCT的研究,是目前检测Hb A1c的金标准。

2.微柱法 微柱内的阳离子交换树脂在p H近7时解离后带阴电荷,而Hb解离后带阳电荷,二者可形成离子键。由于GHb的阳电荷比Hb A少,与树脂的结合力相对低,容易被洗脱。用分光光度计分别测定洗脱液中GHb和溶血物中总Hb的吸光率(A),可计算出GHb占总Hb的百分比(%)。但此方法的影响因素比较多。

(1)洗脱温度对结果有较大影响。

(2)抗凝剂肝素能使测定结果增高。

(3)某些血红蛋白,如HbF异常增加时,也会与糖化血红蛋白同时洗脱,从而使结果产生偏差。

手式微柱操作会受到人工因素影响,可能会洗脱不完全或过度洗脱并受外界环境温度的影响,而某些血红蛋白,如HbF异常增加时,也会与糖化血红蛋白同时洗脱,从而使结果产生偏差。

3.电泳法 胶体颗粒在一定条件下可以带有电荷,带有电荷的胶体颗粒可以借静电吸引力在电场中泳行,带正电荷者泳向负极,带负电荷者泳向正极,此种现象称为电泳。血清中各种蛋白质都有它特有的等电点,各种蛋白质在各自的等电点时呈中性状态,它的分子所带正电荷与所带负电荷量相等。但此方法的弱点有以下几点。

(1)需成批进行样本分析,速度比较慢,无法进行实时检测。

(2)自动化程度低,急诊插入、自动维护等功能比较欠缺。

Hb及Hb A1带正电荷,电泳时向负极移动。因为Hb A的β链N-末端所带电荷被糖基消除,带电量少于Hb A,等电点低,泳动速度慢,所以Hb A1即GHb本身带红色,可直接比色或扫描。用Hb A1占Hb的量来表示。毛细管电泳也能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。普通电泳法对Hb A和Hb A1分离效果不理想,目前尚无商品化且具有批量样本通过能力的仪器面世,相当程度地限制了该方法的临床应用。

4.亲和层析法 利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统。带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下,能以某种次级键与已固相化的配基结合,而杂质则不吸附,除去杂质后变换条件,又可以使待分离的高分子物质重新解离,获得纯化。

除葡萄糖外,血液中所有的糖类都可与Hb相结合,因此,该方法的检测结果为糖化血红蛋白总量,而不是Hb A1c的含量。

5.免疫法 使用单克隆或多克隆抗体直接测定血红蛋白β-链上糖基化的N末端的4～8个氨基酸,因此,对Hb A1c上的糖基特异性好。但是许多同源的糖化血红蛋白变体也有相同的N末端结构,从而会对结果造成干扰。在定标方面,需与HPLC作相关校正。

6.等电点聚集法 也是测定GHb的新技术,它是在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的p H梯度,溶血液中各个组分将移动到各自的等电点的p H位置上,这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带,通过分辨率高的微量光密度仪扫描,可以准确地测定出各自组分的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的Hb A、Hb Ac、HbF、HbS及HbC等,可完全避开各种物质的干扰,是一种理想的方法,但仪器价格相当昂贵,难于用作常规检测。

7.离子捕获法 是近来发展起来的新方法,代表仪器有Abbott的IMX,其原理是糖化血红蛋白与相应抗体结合后,联以荧光标记物,形成一反应复合物,再联结带负电荷的多聚阴离子复合物,而在IMX反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物,使纤维表面带正电,使前述的反应复合物吸附在纤维表面,经过一系列清洗后测定其荧光强度,从而得到糖化血红蛋白的浓度,该方法适用于成批糖化血红蛋白标本的检测。

8.免疫凝集法 糖化血红蛋白与相应的单抗结合进而发生凝集反应,通过测定吸光度来表示凝集量,可用于全自动生化分析仪上进行测定。以免疫分析为基础的仪器在最近几年中得到推广,约在7min内就能读取数据,要求对样品成批试验,每次试验均应使用一个新试剂盒,操作前应注意混匀试剂。免疫比浊法重复性较好,但易受脂肪血、黄疸等样本因素影响,抗交叉污染较差,而且要求血红蛋白在一定范围之间才能达到较好的线性。

9.金标免疫渗滤法(金标法) 免疫渗滤法,操作较简便,目前代表仪器有挪威Nyco Card ReaderⅡ特种蛋白多功能全定量金标检测仪。

10.化学发光法 采用离子捕捉免疫分析法,应用抗原抗体反应原理,联以荧光标记物,通过连接带负电的多阴离子复合物,吸附到带正电的纤维表面,经过一系列彻底清洗等步骤后,测定荧光强度变化率,计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复,可减少操作技术误差,检测的灵敏度和特异性高,批内、批间变异系数小,回收率高,准确度高,交叉污染率小,影响因素少。

11.放射免疫法 优点是精密度高、特异性强、快速、价格相对便宜,可批量测试,且不受各种干扰因素的影响。缺点是目前对制备高效价的抗体尚存在许多困难,仍处于研究中,未能形成商品化试剂盒。

12.酶法 原理为用特殊蛋白酶分解Hb,3～5min内果糖基氨基酸从Hb分离,果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)从果糖基氨基酸产生H 2 O2,H 2 O2经POD与DA-64反应,选择751nm测吸光度改变求得GHb浓度。

四、评 价

根据上述各种测定方法的特性,从方法的精确性评价,当然以专一化测定HPLC法最为理想,但因其价格十分昂贵,我国尚不能广泛采用。目前国内多采用的阳离子交换树脂微柱法,因易受诸多干扰因素影响,误差较大,不是一个理想的方法。比色法也有的医院应用,但因操作烦琐,稳定性差亦不够理想。从多方面评价,适于目前我国国情并能在各级医院广泛开展的作为首选的应是亲和色谱微柱法。该法除具备上述优点外,如果试剂盒质量合格,其精确度亦较高。因此,国外许多学者也多推荐本法。近年国外正在对各测定GHb方法进行标准化处理,但这种标化处理过程较复杂。

标化处理者认为,经标化的亲和色谱GHb值几乎与Hb A1值相像,基本与HPLC法所得值相似。值得指出,目前国内生产的亲和色谱微柱法试剂盒,多数尚不符合质量要求,建议使用者在选择某试剂盒时应首先进行有关质量检验,并建立各自参考标准。