动物分型技术

一、动物DNA分型技术

近年来动物基因组计划取得了巨大进展，牛和狗的全基因组图谱分别已于2006年8月和2005年12月完成，猫的全基因组草图已于2007年10月绘制完成，猪的全基因组图谱也已取得阶段性成果，动物基因组数据资料日益丰富。牛、猪、狗和猫的基因组无论在大小、复杂度和结构上都与人十分相似。其中牛有30对染色体，大约有29亿个碱基对；猪有19对染色体，大约有30亿个碱基对；狗有39对染色体，大约有24亿个碱基对；猫有19对染色体，大约有27亿个碱基对。对于动物基因组的研究主要集中在种群识别，与控制动物生产性能、抗病力等经济性状相关的基因结构与功能，或是分子标记辅助选择上。主要采用的遗传标记与人类基因组DNA相同，包括短串联重复序列（short tandem repeat，STR）、线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等，检验方法相似。

1．动物的STR分型1985年，STR首次被描述存在于人类基因组中，这些标记也很快被用于其他物种。1993年首次报道了牛STR基因座。1996年报道了狗的四核苷酸重复序列。

目前越来越多牛、猪、马、狗、猫等动物的STR基因座相继被发现（图27－1，见彩插）。YAMAGUCHI A等复合扩增了牛的5个高度多态性STR基因座，进行常规序列分析（SEQ）和微晶片电泳（MEP）。凌凤俊等采用荧光标记PCR引物建立了牛的6个STR基因座复合扩增系统，6个基因座的联合个体识别力为大于0．999 999 9，联合非父排除率为0．992 256 863 93。叶俊华等采用多重PCR和四色荧光（5’FA N1，JO E，N ED和ROX）检测技术调查了中国警犬种犬PEZ1，FHC2054，FHC2010，PEZ5，PEZ20，PEZ12，PEZ3，PEZ6，PEZ8和FHC2079等10个STR基因座多态性。结果显示，该体系的非父排除率（PE）为99．728 7%，个体识别力（DP）为99．999 1%。

美国Applied Biosystems公司2005年生产的StockMarks^是目前唯一可用于牛、狗和马3种动物中进行DNA分型的商品化试剂盒，3种体系分别包括11个、10个和12个STR基因座的复合扩增。

2．动物的mtDNA分型在犯罪现场收集到的动物毛发都是自然脱落并处于毛发生长终期，一般都有毛根，但是缺乏毛囊组织。如果STR分型失败，则可以利用线粒体DNA控制区序列分析帮助处理案件。毛根的生发层细胞中有成百上千个拷贝的线粒体DNA，在陈旧样本中也不易降解。动物的线粒体DNA也来源于母亲。SAVOLAINEN等研究了狗单根毛发的mtDNA控制区串联重复序列的个体识别能力，认为狗单根毛发的mtDNA控制区重复类型多态性（repeat type）可用于个体识别。

目前对于动物mtDNA分型的研究目标也主要集中在mtDNA控制区序列高变区域（hypervariable region），采用的方法主要是直接测序法。结果与参考序列进行比对，按照IUPAC（国际纯粹与应用化学联合会）的原则进行单倍型命名。常见家养动物的mtDNA基因组序列在GenBank上均有提供，如猫（NC－001700）、牛（NC－001567）、狗（NC－002008）、马（NC－001640）、猪（NC－000845）等；野生动物如鹿（NC－004563）、熊（NC－003426）等。

与人类相比，动物的单倍型较少，其共有单倍型（common haplotype）的频率更高。QuestGen狗数据库中的数据通过检测348只狗（其中303只纯种狗，来自于88个种属，另外45只为杂种狗）的mtDNA控制区的655 bp片段，结果共观察到63个线粒体单倍型，其中有17种单倍型的频率均大于1%，有46种单倍型的频率小于1%。大约50%狗拥有4种最常见的共有单倍型，频率为9%～17%；25%的单倍型频率为2%～5%。在家庭拥有多只宠物的情况下，多只动物的单倍型频率计算可以增加mtDNA分型的鉴别能力。

mtDNA由于多态性较低、母系遗传、存在异质性和分析技术繁复的原因，因此一般在缺乏含细胞核的检材或STR分型结果不理想时才采用。

3．动物的SNP分析SNP位点表现为二态，与其他的DNA标记相比，虽然每个SNP位点的信息量不如STR多，但其在基因组中密集分布和数量庞大的特点弥补了其不足。近年来，SNP分型技术逐渐被应用到动物医学领域。HEATON等研究了分布在18条常染色体和2条性染色体上的32个SNP位点，杂交牛和纯种牛的非父排除率分别达到99．9%和99．4%。GOFFAUX等研究了由猪基因组非翻译区的40个SNP组成的检测体系，其随机匹配概率达到7×10^－9。WEBB等对79只家养狗的mtDNA控制区外序列（共15 484 bp）进行SNP分析，结果发现了356个SNP位点和65种单倍型。