甲型和乙型流感病毒测定

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，可造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速地传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等。病毒最早是在1933年由英国人威尔逊·史密斯（Wilson Smith）发现的，他称为H1N1。H代表血凝素，N代表神经氨酸酶，数字代表不同类型。根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类：甲型流感病毒（influenza A virus），又称A型流感病毒；乙型流感病毒（influenza B virus），又称B型流感病毒；丙型流感病毒（influenza C virus），又称C型流感病毒。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行，至今尚未找到它存在于人之外其他动物中的确凿证据。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行，猪也是它天然宿主之一。

流感在流行病学上最显著特点为突然暴发，迅速蔓延，波及面广，具有一定的季节性（我国北方流行一般均发生在冬季，而南方多发生在夏季和冬季）。一般流行3～4周后会自然停止（世界性大流行常有2～3个流行波），发病率高但死亡率低。感染率最高的为青少年，高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不同程度的死亡。

根据世界卫生组织的统计数据，全球每年有300万～500万人因感染流感病毒而严重发病。流感疫苗是人们抵御流感的有力武器，每年大约使3亿人免受流感侵袭。一个国际研究小组研究发现，季节性的流感病毒毒株通常首先在亚洲出现，然后在几个月内传至世界其他地区。这是科学家得出的最新的季节性流感病毒传播“路线图”，有望帮助更有针对性地监测流感。来自欧洲、澳大利亚、日本和美国的科学家对多达1．3万个来自世界各地的H3N2亚型流感病毒的样本进行了研究。H3N2是A型（甲型）流感病毒的一个亚型，也是目前导致人类染病甚至死亡的主要流感亚型。每年H3N2病毒毒株在东亚和东南亚出现，并在那里交叉传播。毒株不断变异，在6～9个月后抵达欧洲和北美。之后，病毒继续传播至南美，通常到达南美之后即渐渐止息。从流感病毒的传播路线来看，应该重点加强对东亚和东南亚地区的流感疫情监测，进而更准确地预测世界其他地区的流感病毒类型，每年为人们提供更有针对性的流感疫苗。另外，鉴于流感的跨地域传播特性，各国科研人员也应该加强在流感监测方面的合作和信息通报。

流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80～120nm，丝状流感病毒的长度可达400nm。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。病毒的核心包含了存储病毒。

流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，简写为ss-RNA，ss-RNA与核蛋白（NP）相结合，缠绕成核糖核蛋白体（RNP），以密度极高的形式存在。除了核糖核蛋白体，还有负责RNA转录的RNA多聚酶。甲型和乙型流感病毒的RNA由8个节段组成，丙型流感病毒则比它们少一个节段，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚酶，第4个节段负责编码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；第7个节段编码基质蛋白，第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。丙型流感病毒缺少的是第六个节段，其第四节段编码的血凝素可以同时行使神经氨酸酶的功能。基质蛋白构成了病毒的外壳骨架，实际上骨架中除了基质蛋白（M1）之外还有膜蛋白（M2）。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合，起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。

当流感病毒在宿主细胞内完成其繁殖之后，基质蛋白是分布在宿主细胞细胞膜内壁上的，成型的病毒核心衣壳能够识别宿主细胞膜上含有基质蛋白的部位，与之结合形成病毒结构，并以出芽的形式突出释放成熟病毒。包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，成熟的流感病毒从宿主细胞出芽，将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞，去感染下一个目标。包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：血凝素和神经氨酸酶。这两类蛋白突出病毒体外，长度为10～40nm，被称作刺突。一般一个流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。

在甲型流感病毒中血凝素和神经氨酸酶的抗原性会发生变化，这是区分病毒毒株亚型的依据。血凝素（HA）呈柱状，能与人、鸟、猪、豚鼠等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血，故而被称作血凝素。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。血凝素具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。神经氨酸酶（NA）是一个呈蘑菇状的四聚体糖蛋白，具有水解唾液酸的活性，当成熟的流感病毒经出芽的方式脱离宿主细胞之后，病毒表面的血凝素会经由唾液酸与宿主细胞膜保持联系，需要由神经氨酸酶将唾液酸水解，切断病毒与宿主细胞的最后联系。因此神经氨酸酶也成为流感治疗药物的一个作用靶点，针对此酶设计的奥司他韦是最著名的抗流感药物之一。

在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株，但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫，即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效。甲型流感病毒是变异最为频繁的一个类型，每隔十几年就会发生一个抗原性大变异，产生一个新的毒株，这种变化称作抗原转变，亦称抗原的质变；在甲型流感亚型内还会发生抗原的小变异，其表现形式主要是抗原氨基酸序列的点突变，称作抗原漂移亦称抗原的量变。抗原转变可能是血凝素抗原和神经氨酸酶抗原同时转变，称作大族变异；也可能仅是血凝素抗原变异，而神经氨酸酶抗原则不发生变化或仅发生小变异，称作亚型变异。对于甲型流感病毒的变异性，学术界尚无统一认识，一些学者认为，是由于人群中传播的甲型流感病毒面临较大的免疫压力，促使病毒核酸不断发生突变。另一些学者认为，是由于人甲型流感病毒和禽流感病毒同时感染猪后发生基因重组导致病毒的变异。后一派学者的观点得到一些事实的支持，实验室工作显示，1957年流行的亚洲流感病毒（H2N2）基因的八个节段中有三个是来自鸭流感病毒，而其余五个节段则来自H1N1人流感病毒。甲型流感病毒的高变异性增大了人们应对流行性感冒的难度，人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，便不能有针对性地进行预防性疫苗接种，另一方面，每隔十数年便会发生抗原转变更会产生根本就没有疫苗的流感新毒株。

流感病毒侵袭的目标是呼吸道黏膜上皮细胞，偶有侵袭肠黏膜的病例，则会引起胃肠型流感。病毒侵入体内后依靠血凝素吸附于宿主细胞表面，经过吞饮进入胞质；进入胞质之后病毒包膜与细胞膜融合释放出包含的ss-RNA；ss-RNA的八个节段在胞质内编码RNA多聚酶、核蛋白、基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶、非结构蛋白等构件；基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶等编码蛋白在内质网或高尔基体上组装M蛋白和包膜；在细胞核内，病毒的遗传物质不断复制并与核蛋白、RNA多聚酶等组建病毒核心；最终病毒核心与膜上的M蛋白和包膜结合，经过出芽释放到细胞之外，复制的周期大约8h。流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成黏膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。病毒感染还会诱导干扰素的表达和细胞免疫调节，造成一些自身免疫反应，包括高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等，病毒代谢的毒素样产物以及细胞坏死释放产物也会造成和加剧上述反应。由于流感病毒感染会降低呼吸道黏膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，所以大大降低了人体抵御呼吸道感染的能力，因此流感经常会造成继发性感染，由流感造成的继发性肺炎是流感致死的主要死因之一。

【检测原理】　甲／乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒核蛋白抗原，这些具有高度敏感性的单克隆抗体和一种对照抗体被固化到膜支持物上，形成三条独特的线，与其他试剂／垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个纸板（书形检测卡）里边。用拭子取得的标本需要进行预处理。用洗脱液、盐水和转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，鼻洗液（吸出物）标本不需要预处理。将标本加到检测条顶端，闭合检测卡。15min时根据紫红色线的出现与否来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。

【适应证】　临床上怀疑为流感病毒感染的患者。

【标本采集】　鼻洗液（吸出物）及鼻咽拭子和鼻拭子，新鲜标本及时检测。

【操作方法】

1．标本预处理。鼻洗液或吸出物标本不需要预处理，直接进行检测；对于鼻咽拭子和鼻拭子，应在0．5～3．0ml的盐水或转移介质中用力搅动拭子以洗脱拭子上的鼻咽液，然后，进入检测程序。

2．测试前将检测卡从包装袋中取出，平放在工作台上。

3．挤压移液管上的吸球并把移液头插入标本中，当吸头在标本中时松开吸球，将液体吸到管中。确保管的下部没有空气。

4．根据检测卡上的箭头找到检测条上部的白色样品垫，将移液管中的全部液体（100μl）慢速（逐滴）加到垫的中部，使所有标本都吸附到垫中。不要将标本加到紫红色垫上。

5．立即揭去检测卡上的黏附衬，将检测卡封闭，15min时读取窗口中的结果。早于15min或晚于15min的结果可能不准确。

【结果判读】

1．阴性结果　窗口底部的蓝色对照线变为紫红色，而无其他线出现。

2．甲型流感阳性标本　蓝色对照线变为紫红色，且它上边的中间那条标本线也变为紫红色，只要有标本线出现，即使颜色很浅，结果也是阳性的。

3．乙型流感阳性标本　蓝色对照线变为紫红色，且它上部最上边的那条标本线也是紫红色的，只要有标本线出现，即使颜色很浅，结果也是阳性的。

4．无效　如果对照线仍为蓝色或根本就没有出现，不管标本线出现与否，结果都为无效。

【参考范围】　阴性。

【临床意义】

1．流行性感冒有季节性，在流行季节，一个地区大量上呼吸道感染的患者明显增加。

2．流行性感冒潜伏期一般为1～2d，短者数小时。

3．起病急，症状变化多样，主要以全身中毒症状为主，畏寒、高热、头痛、全身疼痛、乏力，可伴有咽痛、流泪、咳嗽等呼吸道症状。患者有食欲减退，或伴有腹痛、腹胀和腹泻等消化道症状。

4．婴儿流感的临床症状往往不典型，可见高热惊厥，部分患儿可表现为喉-气管-支气管炎。新生儿流感虽少见，但一旦发生常呈败血症表现，常伴有肺炎，病死率高。

【局限性】

1．阴性结果不能排除存在甲／乙型流感感染的可能性，因此，甲／乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）获得的结果要与临床检查相结合，以便做出准确的诊断。如若需要其他能区分甲型和乙型流感病毒特异亚型或株的试验，请向国家或地方卫生部门垂询。

2．甲／乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）能检测甲型和乙型流感的死病毒与活病毒，试验性能取决于标本中的抗原载量，可能与同一份标本的细胞培养结果无相关性。

3．甲型和乙型流感病毒在靶表位区氨基酸的微小改变都可能造成单克隆抗体不能检测或检测敏感性下降。

4．甲／乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）监测抗病毒治疗的性能尚未确立。

5．体外诊断试验的阴性和阳性预测值对疾病的流行性依赖非常大，假阴性结果更可能出现在疾病流行性很强的峰活动期，假阳性结果更可能出现在轻中度流行性的低病毒活动期。

6．血性标本可能不适用于此甲／乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）。

7．用鼻吸入法接种甲型流感疫苗的个体，接种后3d内用流感快检试剂检测，可出现阳性结果。儿童排出病毒的数量和排毒持续时间都超过成年人，因此，成年人对流感体外诊断的敏感性要低于儿童。

【方法学优点】

1．简便、快速，15min即出结果。

2．此方法的敏感性以及特异性均较高，重复性非常好。