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股骨头坏死的基因治疗

时间:2023-03-27 理论教育 版权反馈
【摘要】:按照基因治疗中受体细胞的不同,可将基因治疗区分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗两种。因为生殖细胞基因治疗涉及社会伦理道德等问题,目前尚未能付诸实施。目前进行的实验性研究和临床应用的基因治疗方案均为体细胞基因治疗途径。他们的实验结果显示基因转染后股骨头坏死区内有大量血管生成,说明VEGF具有促进血管内皮细胞向坏死骨内迁移形成血管的功能,基因转染能显著增加股骨头坏死区血流量。

基因治疗(gene therapy)是把具有特殊功能目的基因片段转入细胞内,在一定的期间改变细胞的功能来治疗或预防疾病。基因治疗是利用生物或非生物的方法,将特定基因封闭抑制或激活来达到治疗目的,目前RNA干扰技术成为基因治疗的研究热点。

基因治疗是随着对遗传性疾病认识的深入和分子生物学技术的发展而诞生的,它是医学界的一大创举。基因治疗概念的提出是在20世纪80年代初期,随后获得了飞快的发展。90年代初期,随着世界首例腺苷脱氨酶(ADA)缺乏性重症免疫缺陷病的治疗获得成功,基因治疗获准用于临床治疗,进而推动了其他一些疾病的基因治疗。

按照基因治疗中受体细胞的不同,可将基因治疗区分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗两种。生殖细胞基因治疗的对象主要是遗传性疾病患者,试图将患者所缺陷的基因转移至其生殖细胞,在受精卵分化之前对该基因进行修饰,从而使其子代包括生殖细胞在内的所有细胞都具有这种基因并可有效表达,其后代个体将不会再患这种疾病。因为生殖细胞基因治疗涉及社会伦理道德等问题,目前尚未能付诸实施。目前进行的实验性研究和临床应用的基因治疗方案均为体细胞基因治疗途径。按照基因转移的技术路线又可将体细胞基因治疗分为间接体内(envivo)法和直接体内(invivo)法两种。从患者体内获得可接受外源基因的靶细胞,在体外将治疗基因转移入该细胞,经过体外筛选、培养、扩增后再将阳性细胞回输到患者体内,使其发挥作用,这是间接体内法。将DNA略加修饰或包裹后直接注射入患者体内适当的部位并有效表达,从而达到治疗目的,这种方法称为直接体内法。

尽管基因治疗前景诱人,但也存在一些难以解决的问题。由于技术上的缘故,转入到靶细胞内的基因还主要是随机整合到靶细胞染色体内,这就不可避免地存在破坏细胞内正常基因表达的可能,甚至会激活细胞内原癌基因从而导致细胞发生恶性转化,发生肿瘤。此外,如何调节外源基因在靶细胞内适时、适量的表达,也是较难解决的问题。由于治疗性基因多采用患者血缘关系以外供者的基因,甚至是异种动物的基因,在治疗过程中,特别是在非致命性疾病的基因治疗中就会产生社会伦理问题。但是,基因治疗毕竟为许多疾病的治疗提供了一种方法学上可行的途径,有理由相信,随着科技的飞速发展,解决以上问题将不会是遥遥无期,基因治疗必将成为克服顽症造福人类的有力武器。

贾勇、初同伟和周跃进行了Ad-huVEGF 121基因转染对兔股骨头Ⅰ型胶原表达及ALP活性影响的实验研究。目的是观察VEGF在坏死股骨头内诱导成骨的作用。具体方法:重组腺病毒Ad-huVEGF121注射入坏死的股骨头,应用酶学和免疫组织化学技术检测血清碱性磷酸酶(ALP)的活性和Ⅰ型胶原(collagenI)的表达。结果:基因转染组活性和表达在各个时相点显著高于空病毒对照组。结论 VEGF具有在坏死股骨头内诱导成骨的功能。VEGF在早期成骨方面具有重要作用,VEGF缺乏,不仅会影响到骨组织的血管生成,还会使成骨细胞、软骨细胞和破骨细胞的分化受阻。在成骨细胞培养液中加入外源性能使成骨细胞碱性磷酸酶的活性提高。他们的实验结果显示基因转染组碱性磷酸酶活性在术后2周达到高峰,以后缓慢下降,各个时相点均高于对照组。说明具有直接或间接促进坏死股骨头内碱性磷酸酶合成的功能。Ⅰ型胶原分泌是成骨细胞成熟的标志之一,我们在基因转染组术后2周就观测到型胶原的表达,随着时间Ⅰ型胶原含量增加,最后形成骨小梁。对照组Ⅰ型胶原的表达量在各个时相点均低于基因转染组,说明具有直接或间接促进坏死股骨头内成骨细胞成熟、合成基质的功能。研究结果显示VEGF具有直接或间接促进坏死股骨头内成骨细胞成熟、合成基质的功能。他们还进行了Ad-huVEGF121基因转染对兔坏死股骨头血流的影响。具体方法是:利用重组腺病毒Ad-huVEGF121注射入坏死的股骨头,应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测VEGF121的表达,观察股骨头内新生血管数量,用SPECT技术观察坏死股骨头的动脉灌注情况。结果显示:转染后的股骨头内VEGF121表达增高,新生血管数量增多,SPECT观察发现坏死股骨头血流量明显增加。腺病毒载体是基因治疗领域内最为广泛应用的病毒载体之一,且已成为体内基因治疗方案的首选载体。其优点是感染谱广,可以感染增殖期和非增殖期的细胞,不整合到靶细胞基因组,瞬时表达,比较安全。实验结果显示,目的基因huVEGF121在组织细胞中的表达10 d左右,转染效率较高。在股骨头坏死的愈合过程中,良好的血运是必不可少的条件,有研究表明,股骨坏死后新生骨呈非随机性分布,是由新生血管的分布所决定的,血供差的地方形成纤维化的概率比较高,说明血管形成血流改善对坏死骨的修复至关重要,而VEGF几乎参与了血管的形成的全过程。他们的实验结果显示基因转染后股骨头坏死区内有大量血管生成,说明VEGF具有促进血管内皮细胞向坏死骨内迁移形成血管的功能,基因转染能显著增加股骨头坏死区血流量。因此,他们得出如下结论:转染VEGF121基因可以增加坏死股骨头新生血管数量和血流量,改善股骨头血液循环。

杨操、杨述华等进行了bFGF基因转染促进股骨头坏死修复的实验研究。目的:为临床治疗股骨头及其他骨缺血性坏死探索新方法。方法:将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒pCD-rbFGF与胶原混合植入坏死的兔股骨头内,术后RTPCR及免疫组化方法检测bFGF表达情况,组织切片及组织形态学分析股骨头内血管生长及新骨形成情况。结果:术后2周RTPCR及免疫组化证实转染bFGF基因的股骨头内有bFGF表达。术后2周股骨头内血管生长与对照组相比,术后8周股骨头内新骨形成与对照组相比,差异均有非常显著意义(P < 0.01)。本实验将bFGF真核表达质粒pCD-rbFGF植入坏死的股骨头内,在股骨头修复过程中,修复组织中的各种细胞,包括间充质细胞、血管内皮细胞及成骨细胞可因其自然吞噬作用摄取pCD-rbFGF质粒,并在细胞内表达bFGF。作者通过RT-PCR和免疫组化在术后2周检测到bFGF的表达。临床上中心减压治疗股骨头缺血性坏死的机制一方面是通过降低骨内压改善血供,同时也通过刺激血供丰富的大转子部的血管沿减压隧道长入股骨头内,促进股骨头坏死的修复。本实验自股骨近端沿股骨颈向股骨头钻孔类似于临床中心减压手术,单纯钻孔组与未做任何处理的股骨头相比,血管生长及新骨形成明显增多。基因转染组股骨头内表达的bFGF能进一步刺激孔内毛细血管生长,在术后2周基因转染组股骨头内血管生长明显多于两组对照组。同时bFGF能促进修复组织中的间充质细胞和成骨细胞分裂增殖,促进股骨头内新骨形成。作者在术后8周发现基因治疗组新骨形成明显多于两组对照组。实验中发现术后4周转染bFGF基因的股骨头内已无bFGF表达,虽然表达时间不长,但已产生明显的生物学效应。本实验对基因转染促进股骨头缺血性坏死的修复进行了初步探讨,研究结果发现bFGF基因转染可促进骨组织内血管再生和新骨形成,提示bFGF基因转染在治疗骨缺血性坏死、骨折不愈合及延迟愈合,骨缺损等具有广阔的应用前景。

曹凯、黄伟等进行了VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究。目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死。方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1(+)载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/ VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组。第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道。股骨头标本术后3d、1周、2周、4周、8周和16周获取。RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复。结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周。血管形成术后2周、4周增加,骨形成术后2周、4周和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P < 0.01)。结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成,促进AVNFH的修复。本实验用DPBVEGF复合物植入坏死股骨头以诱导血管的发生,促进早期坏死股骨头的修复与现有的治疗方法相比较,其优点有:较单纯髓芯转孔减压、非血管化骨瓣移植成血管成骨更早,本实验第一组早期血管形成较第二和第三组多,结果具有显著性差异,早期成骨较后两组多,骨转换较后两组快,术后远期可恢复股骨头髓内正常结构;较血管化骨瓣移植操作更简单,创伤更小,无需进行血管显微吻合,操作过程与髓芯转孔减压相似;更无截骨术造成的生理和解剖结构的改变。

肖承江、胡志明等进行了VEGF治疗激素诱发兔股骨头缺血性坏死的初步实验研究。目的:评价股骨头内直接穿刺注射血管内皮生长因子(VEGF)治疗股骨头缺血性坏死的可行性。方法:将24只体重1.5~2 kg实验用人白兔随机分成A,B,C 3组,A组为对照组;B,C组为激素性股骨头缺血性坏死模型组;制成模型后C组股骨头内注入500μg VEGF。1个月后摄X线平片观察股骨的形态、密度和骨小梁结构,光镜下观察骨的坏死和修复程度骨陷窝数、软骨下骨血管结构、数量和直径,对3组结果做统计学分析。结果:大体标本和X线观察:A、C两组兔股骨头形态基本完整,B组骨质明显疏松并见软骨有黄色坏死灶,C组骨质较A组略显疏松但切割阻力大,表明骨质较B组更硬。X线平片:A组无异常发现,B组显示股骨头密度不均且有1例单侧股骨头明显变形,骨小梁模糊,C组除骨小梁略微不清外,形态和骨密度均正常。光镜下观察:A组为正常骨组织结构表现。B组见软骨层变性坏死,骨细胞核固缩、深染,表明有骨细胞死亡,骨髓内脂肪空泡明显多于其他两组,血管壁有炎性改变。C组骨小梁稍显模糊,骨髓内脂肪空泡虽比A组稍多,但比B组少,并可见明显的造血组织。三组空缺骨陷窝百分比和毛细血管数及血管直径检查结果,B组骨陷窝空缺比最高,分别与A、C组比较差异均有统计学意义。A组毛细血管最丰富,发育成熟,与C组比较毛细血管数和管径差异无统计学意义,与B组比较差异有统计学意义,与B组比较C组毛细血管数和管径及骨陷窝空缺百分比均有显著改善,两组差异具统计学意义。结论:股骨头内直接注射VEGF治疗股骨头缺血性坏死具可行性,值得更深入研究。

曹凯、安洪等报道了脱蛋白骨复合血管内皮细胞生长因子质粒促进兔股骨头早期缺血性坏死修复的实验研究。目的:探索一种治疗股骨头早期缺血性坏死(avascular necrosis of femoral head,AVNFH)的新方法。方法:69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔,随机分成3组。A组,脱蛋白骨(deproteinized bone,DPB)复合pcDNA3.1血管内皮细胞生长因子165(vascular endothelial growth factor165,VEGF165)质粒植入坏死的股骨头内;B组植入DPB;C组仅在股骨头内钻一隧道。术后3 d,1周、2周、4周、8周和16周切取股骨头标本。用RT-PCR检测VEGF165 mRNA的表达;Western blot和免疫组织化学技术检测VEGF165蛋白的表达;X线片观察成骨情况;组织形态学分析血管发生和新骨形成情况。结果:A组术后3d即有VEGF165 mRNA的表达,术后1周达高峰,表达时间超过3周;术后2周、4周和8周I型胶原的面积积分光密度值分别为0.29±0.11、0.55±0.13 和0.67±0.10 IOD/μm2,与B、C组比较差异有统计学意义(P < 0.01);X线片示A组骨痂形成早且多,B组术后4周、8周骨痂少于A组,C组骨痂生成不明显;术后2周和4周A组血管面积积分光密度值分别为0.33 ±0.10和0.57±0.16 IOD/μm2,与B、C组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。 结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF165复合物可增加骨形成。DPB联合VEGF 165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础。

余开湖、冯敢生等报道了携带Ang-1的MSCs对ANFH模型实验修复过程的影响。目的:探讨携带血管生成素基因(Ang-1)的骨髓间质干细胞(MSCs)对股骨头缺血性坏死(ANFH)的修复作用。材料与方法:将80只造模兔随机分为钻孔注入组、动脉灌注组、双介入组、对照组,实验组采用经皮穿刺股骨头钻孔,直接注入携带Ang-1的MSCs,和(或)经颈动脉穿刺,行超选择插管至双侧股骨头供血动脉,缓慢注入携带Ang-1的MSCs,对照组不做处理,术后2周、4周、6周、8周分别进行DR、CT、MRI、DSA检查,观察骨质及血管情况。结果①DR显示实验组股骨头密度增高,尤以双介入组明显,高于同期对照组。②CT、MRI灌注成像见实验组4周后血流量增多,尤以双介入组明显,多于同期对照组。③DSA可见实验组的新生血管及侧支循环数目增多,尤以双介入组明显,多于同期对照组。介入组转染增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)/Ang-1质粒的MSCs分化的细胞在荧光显微镜下见高表达Ang-1基因,同时局部循环血管和成骨细胞增多。明显好于单独治疗组、对照组。结论:携带Ang-1的MSCs经双介入治疗不仅能促进毛细血管的生成,而且能定向进行骨分化;携带Ang-1的MSCs经双介入治疗对ANFH有明显的修复作用。

叶建红、宁亚功等研究了血管内皮生长因子基因在兔股骨头滑膜细胞的表达。目的:观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因在兔股骨头滑膜细胞的表达,以期为股骨头缺血性坏死的基因干预提供实验依据。方法:选择健康成年24周龄以上的日本大耳兔12只,对照组和基因组各6只。将重组VEGF基因的真核表达载体(pcDNA/VEGF)和空载体pcDNA各200μg分别注入基因组和对照组兔髋关节腔,采用免疫组化法检测pcDNA/VEGF和pcDNA在滑膜细胞中的表达。结果:VEGF基因转染7 d后,可见pcDNA/VEGF在滑膜细胞高效表达,而对照组(空质粒pcDNA)则无。结论:重组VEGF基因可在兔股骨头滑膜细胞中表达,促进股骨头缺血坏死处新生血管形成和侧支循环建立,为基因干预股骨头缺血性坏死提供了理论基础。

杨操、杨述华等报道了血管内皮生长因子基因转染促进股骨头坏死修复的实验研究。目的:探索治疗股骨头及其他骨缺血性坏死新方法。方法:将血管内皮生长因子真核表达质粒pCD-hVEGF165 200μg与胶原混合植入坏死的兔股骨头内,术后2周、4周用免疫组化SABC方法检测血管内皮生长因子(VEGF)表达情况,组织形态学分析术后2周、4周修复区血管生成情况及术后6周、8周股骨头新骨形成情况。结果:免疫组化检测:术后2周见基因转染组股骨头内部分细胞胞质被染成棕黄色,证明股骨头内部分细胞摄取pCD-hVEGF165质粒并表达了VEGF;术后4周基因转染组的股骨头内均未见细胞胞质显色,证明4周后己无VEGF表达。两个对照组术后2周、4周免疫组化检测均未见细胞胞质显色,证明无VEGF蛋白质表达。组织切片:发现经液氮冷冻后整个股骨头均坏死。术后2周,基因转染组及单纯钻孔组股骨头钻孔中及周围的骨小梁间隙被大量以间充质细胞为主的修复组织所充填,基因转染组血管生成明显多于单纯钻孔组。术后4周,基因转染组孔中及周围坏死骨小梁表面可见少量新骨形成。术后2周,未做处理组股骨头坏死区边缘靠近股骨颈部位见修复组织开始增生。4周后可见坏死区边缘坏死骨小梁间隙充满间充质细胞。组织形态学分析:术后2周、4周基因转染组修复区血管面积比高于两个对照组,差异有显著性。单纯钻孔组修复区血管面积比与未做处理组相比,差异也有显著性。基因转染组术后6周孔中及周围坏死骨小梁表面见新骨形成明显,术后8周孔中及周围坏死骨小梁表面可见大量新骨形成,孔中新形成的骨小梁间隙可见正常的骨髓组织。单纯钻孔组术后6周及8周孔中及周围骨小梁表面新骨形成少于基因转染组。未做处理组术后6周及术后8周后可见靠近股骨颈坏死骨小梁表面新骨形成更少。组织形态学分析:术后6周及8周基因转染组股骨头修复区新骨形成与两个对照组相比,差异有显著性。单纯钻孔组修复区新骨形成与未做处理组相比,差异也有显著性。结论:利用VEGF基因转染刺激坏死骨组织内血管再生,可促进坏死骨修复,为临床治疗骨缺血性坏死提供了新的研究方向。

刘日光、杨述华等报道了应用血管内皮生长因子基因治疗股骨头缺血性坏死的实验研究。目的:通过建立犬股骨头缺血坏死模型,探讨应用脱蛋白骨复合转染血管内皮生长 因 子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因骨髓基质细胞植入治疗股骨头缺血坏死的可行性。方法:实验选取36只成年犬,随机分为3组,每组12只。A组为脱蛋白异体骨复合转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞;B组为脱蛋白异体骨复合未转染基因的自体骨髓基质细胞;C组单纯植入脱蛋白骨材料。采用液氮冷冻法制作狗股骨头缺血坏死模型,将细胞骨材料复合物植入缺血坏死股骨头内。应用微循环灌注方法了解股骨头内的血运情况,组织形态学观察坏死股骨头的修复情况,免疫组化方法检测VEGF的表达,骨密度仪测定股骨头的骨密度。结果:A组4周后股骨头内有VEGF表达,12周后股骨头内有大量的树枝状血管生成,大量新骨形成,骨密度增高;B、C组均无VEGF基因表达,B组有部分新骨及血管生成,C组仅见少量类骨质形成,血管再生不明显。结论:利用脱蛋白骨复合转染VEGF基因的骨髓基质细胞可促进新骨形成与血管再生,有利于促进坏死骨的修复。

史有志、潘振国等利用重组合异种骨植入、留管介入碱性成纤维细胞生长因子治疗股骨头缺血性坏死。目的:探讨采用重组合异种骨(RBX)移植及留管介入碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF,商品名:扶济复)治疗股骨头缺血性坏死的疗效。方法:对Ficat Ⅱ~Ⅲ期的15例(17髋)股骨头缺血性坏死患者行死骨清除重组合异种骨移植、留管介入碱性成纤维细胞生长因子的治疗。术后定期随访,X线片、CT扫描观察疗效。结果:随访时间2~6.5年,平均4.1年。手术前、后采用股骨头缺血坏死疗效百分评价法对患髋功能进行评价。单髋病例由术前平均42.1分改善至术后平均86.3分,提高44.2分。术后X线示股骨头外形明显改善,最后复查时全部患者的股骨头都能维持术后的形态,只有1例双髋Ⅲ期病例出现退行性变,关节活动受限外,其余患者均对治疗结果感到满意。结论:重组合异种骨具有诱导成骨能力,又不引起免疫排斥反应。碱性成纤维细胞生长因子可诱导成纤维细胞生长,增加毛细血管数量,刺激成骨细胞数目增加,功能活跃。在两者的共同作用下,加速骨坏死新骨的生成。此方法结合带血管蒂髂骨移植由单向成骨形式变成为双向成骨。

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