微生物培养

用人工培养基或活细胞进行的微生物的分离和培养是确定微生物存在的确定依据。大部分情况下，培养技术是微生物诊断的金标准。培养是确定特殊病原存在标本中的最特异的方法，病毒或细菌的纯培养也是体外确定表型和抗生素敏感性试验的基础。

细菌、分枝杆菌、支原体和真菌可在液体或固体人工培养基上培养。液体培养基对于含少量微生物的标本有相对较好的敏感性，因为液体肉汤比琼脂平皿内可以加入多量的标本。但是，液体培养基不能一步诊断混合感染或定量。而固体琼脂培养基虽然较液体培养基的敏感性稍差，但可以进行菌落计数和直接观察形态来诊断。对于厌氧菌，必须在厌氧的环境中培养，如厌氧箱或厌氧袋。也可以通过与抑制非致病菌而不抑制致病菌的抗生素混合而制造选择性培养基，对于有正常微生物生长的痰和粪便标本中病原微生物的分离和鉴定特别重要，有时，鉴别培养基的制作是通过加入一种或多种糖，调整pH值适合抑制剂的作用，用于分离和筛查不同的微生物。几种显色培养基（MRSA-ID，MRSA-选择性和CHROM琼脂MRSA）可用于临床进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的调查。从血液等标本中分离微生物是临床微生物实验室的一项重要任务。

（一）体液的微生物仪器培养操作规程

1．检验目的

通过体液的仪器培养提高检测阳性率，对血流感染、胸腔积液、腹水感染进行病原学诊断，并根据病原菌特征做相应的药物敏感性试验，指导临床诊治和流行病学研究。

2．检测原理

BacT/Alert检测系统由一个传感器和一个比色探测器构成。传感器对CO2敏感并附着在血培养瓶的底部，比色探测器由位于培养箱内每个瓶孔底部的一个发光二极管和一个吸收光二极管组成。传感器通过CO2渗透膜把肉汤隔开，细菌产生CO2通过薄膜扩散并与传感器中的染料反应，产生一个颜色变化，由蓝黑绿变成黄色。光电二极管探测器产生一个电压的信号并与传感器中的颜色变化成比例。当培养瓶放入血培养仪后，仪器可以自动连续孵育、连续震荡、15 min一次的自动检测及24 h的警示报告等多项功能。

3．设备性能参数

见血培养仪操作规程。

标本见标本采集及处理程序。

4．容器和添加剂类型

厌氧培养瓶、中和抗生素培养瓶及需氧培养瓶。

5．试剂

血平皿、中国蓝培养基、巧克力培养基、克氏双糖铁培养基、沙氏培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基、MH培养基。

6．仪器设备

接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、2ml无菌注射器。BacTAlerT 3D 120血培养仪、BacTAlerT 3D 240血培养仪。OLYMPUS光学显微镜、电热恒温培养箱、SANYO-CO2培养箱、Hfsafe-1200生物安全柜、隔水式培养箱、BCD268H大王子冰箱。

7．校准步骤

培养箱、离心机由302医院仪器科校准；生物安全柜、BacTAlerT 3D血培养仪由生产厂家定期校准。

8．操作步骤

见血培养仪操作规程。

9．结果报告

9.1血液细菌培养检查必须报告细菌的种属及相应的药敏结果。

9.2真菌培养检查酵母菌尽量报告真菌的种，丝状真菌可报告到属。

9.3 检验结果的输入：检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于血、胸、腹水培养标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

9.3.1 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

9.3.2 结果录入，阴性标本：在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。阳性标本：药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌，双击，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.3.3 对于无条形码的申请单，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击即可。

9.3.4 结果录入，阴性标本：在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。阳性标本：药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌名称，双击细菌名，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.4 检验结果的确认　应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”，输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

10．报告时间

培养瓶报警即下瓶涂片、革兰染色，初步报告给临床结果，同时传种血平皿、巧克力平皿及中国蓝琼脂平皿，并进行初步药敏试验，经16～18 h后（部分24 h）报初步药敏结果，培养的单个菌落完成鉴定和标准化药敏，再18 h报告鉴定及精确药敏结果。若培养7 d仍无细菌生长者，报告无菌生长。怀疑亚急性细菌性心内膜炎者，延长培养至2周再发出阴性报告。

11．质量控制

室间质控：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：包括血培养仪的质控和培养基的质控，见血培养仪操作规程和细菌鉴定操作规程。

12．干扰因素

抽取标本时未严格无菌操作，易造成假阳性；患者抽取标本前用药易造成假阴性；培养仪失控易造成假阳性或假阴性。

13．生物参考区间

正常人体液中无菌，培养阴性。

14．临床意义

14.1 阳性：血培养阳性对患者的诊断和预后有重要的意义。当细菌或真菌在血液中迅速繁殖，超出网状内皮系统清除这些微生物的能力时，产生了持续的菌血症，增加患者病情的严重程度和病死率。随着广谱抗生素的应用、免疫力低下人群的增加、条件致病菌的增多，血流感染率在增加，耐药菌株也在增加，故准确培养鉴定出血流感染的病原菌并药敏试验，对患者的及时诊治从而改善预后至关重要。对血液中分离到的每一种细菌需要详细分析、认真对待，我院肝硬化患者的败血症病原菌多为肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、气单胞菌、沙门菌等，革兰阳性球菌包括金黄色葡萄球菌、肠球菌。

14.2 阴性：血培养阴性时，表示血瓶中无微生物生长。

15．安全性预警措施

见《生物安全手册》。

16．参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社．2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出版社，2006．

[3] 张秀珍．当代细菌检验与临床．北京：人民卫生出版社，2000．

（二）脑脊液微生物培养操作规程

1．检验目的

中枢神经系统感染的病原学诊断，查找与脑膜炎有关的病原菌，指导临床治疗和流行病学的调查。

2．设备性能参数

见培养箱、离心机操作规程。

3．标本采集

见标本采集及处理程序。

4．试剂

血平皿、中国蓝培养基、巧克力培养基、沙氏培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基。

革兰染液、抗酸染液、印度墨汁、氧化酶试剂、3%触酶、生理盐水。

5．仪器设备

5.1 接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片。

5.2 OLYMPUS光学显微镜、电热恒温培养箱、SANYO-CO2培养箱、Hfsafe-1200生物安全柜、B120医用低速离心机、隔水式培养箱、BCD268H大王子冰箱。

6．校准程序

培养箱、离心机由302医院仪器科校准；生物安全柜由生产厂家定期校准。

7．操作步骤

7.1 检查标本留取和运送是否合格，不合格标本电话通知临床重新留取，并同时做标本不合格记录；合格标本进行电脑签收。

7.2 细菌的分离培养：脑脊液经3 000 r/min离心，10～15 min，弃上清，用接种环取1环沉淀物，分别接种于复温的血平皿、中国蓝平皿、巧克力平皿，分别放于CO2培养箱内培养48 h，观察结果。如有菌落生长，做革兰染色，根据染色结果做进一步鉴定。培养72 h如无细菌生长则发阴性报告。

7.3 真菌的分离培养及鉴定

7.3.1 真菌的培养：用接种环取1环离心后的沉淀物接种到沙氏培养基，放于28℃真菌培养箱内培养1周，每天观察生长情况，如有真菌生长则进一步鉴定，如无真菌生长则报告阴性。

8. 结果报告

8.1 脑脊液细菌培养检查必须报告细菌的种属及药敏结果。

8.2 脑膜炎乳胶凝集试验要报告具体的细菌或血清型。

8.3 检验结果的输入　检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于脑脊液培养标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

8.3.1 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

8.3.2 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌，双击，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

8.3.3 对于无条形码的申请单，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击即可。

8.3.4 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌名称，双击细菌名，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

8.4 检验结果的确认　检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”，输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

9．干扰因素

9.1一般脑脊液放入无菌试管，标本量1～2 ml。

9.2常温15 min内运送，不可冰箱保存。

9.3如果只采集了一管脑脊液，应先送微生物实验室。

9.4采集脑脊液的试管不需要加入防腐剂。

10．生物参考区间

正常人体脑脊液无菌，培养阴性。

11．质量控制

室间质控：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：培养基的质控，见室内质控操作规程。

12．临床意义

细菌性脑膜炎是一组病情较严重的急性感染性疾病，及时的病原学诊断至关重要，一旦有阳性结果应立即电话通知临床医师。本病由多种致病菌引起。除因结核杆菌引起的脑膜炎称为非化脓性脑膜炎、真菌引起的真菌性脑膜炎外，其他细菌引起的脑膜炎，因可引起脑膜化脓性改变，统称为化脓性脑膜炎，其死亡率较高。脑脊液中长出任何菌都是致病菌，常见的引起脑膜炎的脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，根据细菌种类的不同做不同的生化反应，不同的药物敏感试验，然后报告。随着免疫低下人群的增加，新型隐球菌的感染率在增加，应引起注意。

13．安全性预警措施

见《生物安全手册》。

14．参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社，2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出版社，2006．

[3] 张秀珍．当代细菌检验与临床．北京：人民卫生出版社，2000．

（三）痰标本的微生物培养操作规程

1．检验目的

检测与呼吸道感染有关的病原菌以及对抗生素的敏感性，指导临床治疗和流行病学的调查。

2．检测原理

通过营养培养基和选择培养基对致病菌进行筛选并鉴定。

3．设备性能参数

见培养箱、离心机、细菌检定仪操作规程。

4．标本

见标本采集及处理程序。

5．容器和添加剂

密封30 ml带螺旋盖的无菌痰盒，装有无菌拭子的密封试管，不加任何防腐剂。

6．试剂和设备

6.1 试剂名称:血平皿、中国蓝培养基、巧克力培养基、克氏双糖铁培养基、沙氏培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基、M-H培养基、革兰染液、抗酸染液。

6.2设备：接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、光学显微镜、电热恒温培养箱、SANYO-CO2培养箱、Hfsafe-1200生物安全柜、B120医用低速离心机、隔水式培养箱、BCD268H大王子冰箱。

7．校准步骤

培养箱、离心机由302医院仪器科校准。

8．操作步骤

8.1检查标本是否合格，不合格标本电话通知临床重新留取，并同时做标本不合格记录；合格标本进行电脑签收。

8.2 痰培养前处理

8.2.1 痰均质化：痰均质化法以用胰酶均质化为多见。其方法为向痰液内加等量的pH 7.6的1%胰酶溶液，放置37℃ 90 min即能使痰液均质化，而对细菌培养无影响。

8.2.2 挑取痰液中脓性或带血部分，涂成均匀薄片，革兰染色镜检，检查标本是否合格，判定标准见标本接收或拒绝的标准及处理程序（PLA302-LJZX-SOP-A-52-WSW），镜检后应作相应记录，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，白细胞>25个/低倍视野或两者比例小于1为合格痰，合格标本再进行培养鉴定。标本接种必须在生物安全柜内进行。

8.3 普通细菌分离培养及鉴定：挑选脓痰带血丝的可疑部分接种到血平皿和中国蓝培养基上，分三区划线接种，放35℃ 5% CO2环境中孵育24 h。观测平皿细菌生长的数量及菌落形态，挑选可疑菌落进行革兰染色。孵育48 h无菌生长者报阴性。

8.4 真菌分离培养及鉴定：挑选脓痰带血丝的可疑部分接种到沙氏培养基上，放28℃的孵育箱孵育24 h。观测平皿真菌生长的情况。如无真菌生长要连续培养7 d发阴性报告，如有真菌生长则进行种属的鉴定和药敏。

8.5 结核培养：痰液经前处理，即用20% NaOH碱液处理，可液化标本，也可杀死杂菌，接种于改良罗氏培养基（含蛋黄、甘油、马铃薯和天门冬酰胺等）,后观察结核分枝杆菌上的菌落特点：呈干燥颗粒状，乳白色或米黄色，形似花菜心。结核杆菌12～24 h繁殖一代，3～4周形成菌落, 通常需4～8周才能报告。

9．结果报告

9.1 痰液细菌培养检查（表11-20）必须报告细菌的种属、所占比例及药敏结果，痰标本在平皿上的菌落量化分级为少见时，不进行鉴定和药敏（除非临床特别需要）。

表11-20　痰标本在平皿上的菌落量化指标

9.2 真菌培养检查酵母菌尽量报告真菌的种属，丝状真菌可报到属。

9.3 检验结果的输入　检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于痰培养标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

9.3.1 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

9.3.2 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌，双击，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.3.3 对于无条形码的申请单，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击即可。

9.3.4 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌名称，双击细菌名，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.4 检验结果的确认　检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”，输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

10．报告时间

痰培养普通细菌阳性最终报告时间48～72 h，阴性48 h报告无菌生长或甲型链球菌和（或）奈瑟菌生长。

11．质量控制

室间质控：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：培养基的质控见细菌鉴定操作规程。

12．干扰因素

12.1 痰标本一定要合格；涂片时挑取脓性、血性等部位的痰。

12.2 痰涂片结果有时与痰培养结果不一致的原因：由于痰标本在进行培养和涂片时选取的部位不一致造成；某些快生长菌所占比例并不多，但由于其生长速度快、营养要求低，能够在培养过程中迅速变为优势菌，掩盖了其他菌的生长，造成涂片结果与培养结果不一致；标本在采集到接种的时间过长，造成一部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸，而非活菌。

13．生物参考区间

正常人痰中有甲型链球菌和奈瑟菌等正常菌群。如分离到其他细菌和真菌并且生长数量较多，则可能为致病菌。

14．临床意义

上呼吸道分泌物中含有大量的正常菌群，下呼吸道分泌物易受到上呼吸道分泌物的污染，所以造成病原菌结果判断的复杂性。要重视以下涂片结果①见有大量单一革兰阴性杆菌或革兰阳性球菌；②见有少量的革兰阴性双球菌或少量G+链球菌，同时可见大量革兰阴性杆菌或G+球菌；如见有以上情况应立即报告临床，帮助临床快速做出诊断和治疗。如能结合培养且培养结果和涂片结果吻合则诊断意义更大。

呼吸道中的病原菌很多属于机会致病菌，与正常菌群同时存在。一般认为仅当数量超过正常菌群时才鉴定及报告其药敏试验。如多次分离到同一病原性较弱的细菌也可考虑为病原菌。

引起呼吸道感染的常见医院感染病原菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、化脓性链球菌及其他肠杆菌科细菌，社区感染病原菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等；结核杆菌从痰中检出，即可认为有临床意义；真菌从痰中检出需结合临床及其他检查。

15．安全性预警措施

见《生物安全手册》。

16．参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社，

2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出版社，2006．

[3] 张秀珍．当代细菌检验与临床．北京：人民卫生出版社，2000．

（四）中段尿微生物培养操作规程

1．检验目的

做泌尿系感染的病原学诊断，查找与泌尿系感染有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗和流行病学的调查。

2．检测原理

计数每毫升的尿液含菌数，如果有菌生长且菌落数>105 cfu/ml（在血平皿上计数>100），有意义，需继续鉴定；真菌培养取尿沉渣接种，若有真菌生长，需要鉴定。

3．设备性能参数

见培养箱、离心机、细菌检定仪操作规程。

4．标本采集

见标本采集与处理程序。

5．试剂和仪器设备

5.1 试剂名称

5.1.1 血平皿、中国蓝培养基、巧克力培养基、克氏双糖铁培养基、沙氏培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基、M-H培养基。

革兰染液、抗酸染液、氧化酶试剂、3%触酶、10%氢氧化钾、生理盐水。

5.2 仪器设备

5.2.1 接种针、1μl定量接种环、普通接种环、酒精灯、显微镜、载玻片、盖玻片。

5.2.2 电热恒温培养箱、SANYO-CO2培养箱、Hfsafe-1200生物安全柜、B120医用低速离心机、隔水式培养箱。

6. 校准步骤

培养箱、离心机由302医院仪器科校准；生物安全柜。

7．操作步骤

7.1 检查标本是否合格，不合格标本电话通知临床重新留取，并同时做标本不合格记录；合格标本进行电脑签收。

7.2 普通细菌的培养：标本接种及培养：用定量接种环取1μl标本接种于血平皿，密集划线涂布均匀；另取一环中段尿标本分区划线接种到中国蓝培养基上，置5% CO2培养箱35℃培养过夜，观察结果。生长的菌落数乘以1 000，则为每毫升的尿液含菌数，如果菌数生长过多不可计数时，则报告>105 cfu/ml。并挑取优势菌菌落做纯培养（若初次分离菌落单一且生长较多时可直接做鉴定），48 h无细菌生长可报告阴性。

7.3 淋病奈瑟菌培养：收到标本后立即接种于预温35℃的淋球菌专用培养基（巧克力平皿加万古霉素3μg/ml、多黏菌素7.5μg/ml、制霉菌素12.5μg/ml）上，置35℃培养箱5%～10% CO2环境中培养24 h。若无细菌生长，则继续培养48 h，若有可疑菌落，按淋病奈瑟菌进行鉴定。

7.4 真菌培养：标本接种及培养：以无菌手续吸取尿液5～10 ml置无菌试管中，以3 000 r/min离心15 min，取沉渣接种到沙氏培养基，放28℃普通温箱内培养24 h，取出肉眼观察菌落特点，如无真菌生长则继续培养，以后每天观察培养基的生长情况直至7～10 d。如有真菌则进行鉴定，如无真菌生长则报告真菌培养阴性。

8．结果报告

8.1 革兰阴性杆菌菌落计数大于105 cfu/ml、革兰阳性球菌菌落计数大于104 cfu/ ml，有诊断意义，可以反映尿路感染的状况。但下列情况放宽包括应用了抗生素、营养条件要求高的病原菌、非晨尿而使尿液在膀胱内停留时间短等。

8.2 尿液细菌培养阳性必须报告细菌的种属、菌落计数（cfu/ml）及药敏结果。

8.3 真菌培养检查酵母菌尽量报告真菌的种属，丝状真菌可报到属。

8.4 如尿液培养同时有三种或三种以上细菌生长时，可视为污染标本，建议重留送检。

8.5 检验结果的输入　检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于中段尿培养标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

8.5.1 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

8.5.2 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌，双击，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

8.5.3 对于无条形码的申请单，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击即可。

8.5.4 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌名称，双击细菌名，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

8.6 检验结果的确认　检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”，输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

9．报告时间

48 h发送结果。

10．质量控制

室间质控：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：包括药敏、鉴定卡、生化试剂、培养基的质控。见室内质量控制。

11．干扰因素

11.1 采集过程未严格按照标本采集及处理程序操作，而造成的标本污染。

11.2 尿液标本采集后未尽快送检，而影响细菌检查的正确性。

11.3 尿液中添加防腐剂和消毒剂。

11.4 尿液采集之前用药。

12.生物参考区间

正常人体尿液培养阴性，如有污染则有细菌生长但细菌数少于104或多于两种细菌。

13.临床意义

尿液细菌培养阳性可辅助诊断尿路感染，并提供敏感的抗生素。泌尿系细菌感染的特点是应用免疫抑制药的患者、老人多、女性患者多，常见的病原菌为大肠埃希菌、肠球菌属（粪肠球菌多于屎肠球菌）、葡萄球菌属、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌；淋病奈瑟菌和衣原体、支原体引起的泌尿系感染的比率也在升高，应加强监测。

14.安全性预警措施

见《生物安全手册》。

15.参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社，

2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出

版社，2006．

[3] 张秀珍．当代细菌检验与临床．北京：人民卫生出版社，2000．

（五）粪便标本的微生物培养操作规程

1．检验目的

指导临床做肠道感染的病原学诊断，查找与腹泻疾病有关的病原菌，指导临床治疗和流行病学调查。

2．检测原理

通过选择培养基筛选肠道致病菌，多数肠道致病菌不利用乳糖，进而在SS培养基上显示为无色透明状菌落，通过进一步生化反应和血清凝集来达到鉴定目的。

3．仪器性能参数

见培养箱、细菌检定仪操作规程。

4．标本

见标本采集及处理程序。

5．试剂

SS培养基、山梨醇麦康凯培养基、伊红亚甲蓝培养基、庆大霉素培养基、克氏双糖铁培养基、尿素酶半固体培养基、碱性蛋白胨水、沙氏培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基、MH培养基。

6．仪器设备

接种针、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片。OLYMPUS光学显微镜、暗视野显微镜、电热恒温培养箱、Hfsafe-900生物安全柜、隔水式培养箱、BCD268H大王子冰箱。

7．校准步骤

培养箱由302医院仪器科校准；生物安全柜由生产厂家定期校准。

8．操作步骤

8.1 检查标本是否合格，不合格标本电话通知临床重新留取，并同时做标本不合格记录；合格标本进行电脑签收。

8.2 肠道门诊的大便标本检测：需在生物安全柜内进行，常规包括便常规、动力试验、制动试验和大便培养，操作程序见下图：

8.3 普通大便培养：在生物安全柜内，挑取粪便带血丝黏液部分或稀水便接种SS平皿、庆大平皿各一块，血水样便加种麦康凯平皿，<2岁小孩加种伊红亚甲蓝平皿，放37℃电热恒温培养箱内培养16～18 h，取出平皿肉眼观察菌落特点。挑选无色或浅黄色的透明或半透明的可疑菌落接种到克氏双糖铁培养基和尿素酶半固体培养基，放37℃电热恒温培养箱内培养24 h。根据反应特点挑选可疑菌进行相应的生化反应及血清学凝集实验，鉴定到细菌种或血清型。

8.4 真菌培养：标本接种在生物安全柜内，挑取粪便带血丝黏液部分或稀水便接种沙氏培养基一块，放28℃普通温箱内培养24 h，取出肉眼观察菌落特点，如无真菌生长则继续培养，以后每天观察培养基的生长情况直至7 d。如有真菌则进行鉴定，如无真菌生长则报告真菌培养阴性。

9．结果报告

9.1 粪便标本细菌培养检查必须报告细菌的种属、血清型及药敏结果。常见的腹泻病原菌包括志贺菌、沙门菌、弧菌、致腹泻的大肠埃希菌（ETEC、EPEC、EIEC、EHEC）、类志贺比邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、气单胞菌、艰难梭菌等。

9.2 真菌培养检查酵母菌尽量报告真菌的种属，丝状真菌可报到属。

9.3 如果悬滴和动力制动试验为阳性，应在6 h内报到上一级卫生防疫部门，并密切关注培养结果。

9.4 检验结果的输入　检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于便培养标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

9.4.1 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

9.4.2 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌，双击，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.4.3 对于无条形码的申请单，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击即可。

9.4.4 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。药敏录入，在预输入结果位置点击回车，在条形框内输入细菌名称或简写，找到细菌名称，双击细菌名，可输入细菌名称及相应药敏表，手动输入药敏，保存。

9.5 检验结果的确认　检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”，输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

10．报告时间

阴性48 h报告结果，有致病菌生长的进一步鉴定和药敏。

11．生物参考区间

普通大肠埃希菌是大便中的正常菌群，如果检测到志贺菌、沙门菌、弧菌科细菌及致泻性大肠埃希菌等则为致病菌。

12．质量控制

室间质控：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：培养基的质控见细菌鉴定操作规程。

13．临床意义

肠道病原菌能引起人类感染性腹泻，其代谢产物能造成食物中毒，亦可由于长期应用抗菌药物而导致菌群紊乱而致严重腹泻，称为抗生素相关性腹泻。很多肠道病原菌可污染食物与水源造成腹泻暴发流行，最常见的是志贺菌感染引起的细菌性痢疾，其他包括沙门菌、气单胞菌、类志贺比邻单胞菌、弧菌引起的肠炎，其中较严重的是O1群和O139群霍乱弧菌引起的霍乱，传染性极强能引起大暴发，传播快，死亡率高，需要密切监测以利早期诊断、及时治疗，也有利于及时切断传播途径以控制疫情蔓延，有重要的临床意义。

14．干扰因素

为提高粪便培养的阳性率，标本应留取脓液或带血部分；宜在抗生素使用前留取；需要无菌便盒送检；不可直接在婴幼儿尿布上直接取样。

15．安全性预警措施

见《生物安全手册》。

16．参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社，

2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出

版社，2006．

[3] 张秀珍．当代细菌检验与临床．北京：人民卫生出版社，2000．

（六）特殊培养条件及培养基的选择

1．L型细菌培养

1.1 由于溶菌酶或抗生素的作用，使细菌细胞壁遭到破坏，形成细胞壁缺陷的细菌即L型细菌。其特征是明显的多形性，大小不一，形态各异包括圆形、卵圆形、膨大的杆状或长丝状。染色不易着色，且不均匀，可在同一视野中出现阴性、阳性混杂现象，或菌体内出现革兰阳性浓染颗粒。细胞壁染色可见细胞壁的缺损和脱壁。

1.2 培养基：高渗液体增菌培养基含有牛肉浸出液800 ml，NaCl 45 g，蛋白胨20 g，调整pH值7.6高压灭菌。固体培养基需加入琼脂10 g和20%的小牛血清。

1.3 生长特性：L型细菌生长缓慢，营养要求高，普通培养基上不生长，必须在高渗的含有血清的培养基上生长，可形成三种类型的菌落。油煎蛋样菌落：菌落较小，中心致密并深陷入琼脂中，四周较薄，由透明的颗粒组成，在低倍镜下观察菌落呈油煎蛋状，较坚硬，不易刮下，表面光滑，边缘整齐；颗粒型菌落：整个菌落由透明的颗粒组成，无致密的核心；丝状菌落：菌落中心如典型L型菌落，但周边呈丝状。

2．分枝杆菌培养

2.1特性：分枝杆菌有快速生长菌与缓慢生长菌，重要的人型分枝杆菌生长缓慢，在人工固体培养基内需12～24 h繁殖一代。该菌为专性需氧菌，5%～10%的CO2可刺激其生长，最适温度35～37℃，最适pH值6.8～7.2尚需一定的湿度。一般2～4周以上始见菌落，在改良的罗氏培养基上菌落粗糙、凸起、呈结节状或颗粒状，边缘薄且不规则，乳白色或淡黄色。

2.2 标本要求及前处理：尿液应留取24 h并静置，留取沉淀30 ml，3 000 r/min离心30 min，弃上清，取沉淀物；胸、腹水的处理同尿液；痰液的液化处理见痰培养操作规程。

2.3 培养观察与报告：取0.1 ml经处理的标本接种于改良的罗氏培养基斜面上，每份标本同时接种2支培养基，分别放于28℃和37℃孵箱内，结核分枝杆菌在28℃不生长。接种后1周内每天观察细菌生长情况，而后每周观察一次直至8周，若见有可疑菌落出现经涂片染色检查见抗酸杆菌后，随时报告“抗酸杆菌培养阳性”，培养8周未见菌落生长者，报告“分枝杆菌培养阴性”。阳性菌报告形式如下：

分枝杆菌培养阴性 无菌落生长

1周内生长的分枝杆菌，应按快速生长的分枝杆菌鉴定

分枝杆菌培养阳性菌落××个 20个菌落以内

分枝杆菌培养阳性（+） 菌落占斜面面积1/4

分枝杆菌培养阳性（++） 菌落占斜面面积1/2

分枝杆菌培养阳性（+++） 菌落占斜面面积3/4

分枝杆菌培养阳性（++++） 菌落生长密集呈苔样

3．厌氧菌培养

3.1 厌氧菌是一大群在无氧条件下才能生长的细菌，包括有芽孢的革兰阳性梭菌和无芽孢的革兰阳性及革兰阴性的杆菌与球菌，存在于人和动物的口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等，在人体正常菌群中，厌氧菌占绝对优势。当不适当地应用广谱抗生素、激素、免疫抑制药、慢性病、外伤等损伤机体免疫力时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染，且多为混合感染。当有需氧菌混合感染时，需氧菌耗尽环境中氧气，有利于厌氧菌的繁殖。

3.2 培养基：固体培养基常用含有氯化血红素和维生素K1的胰酶解酪蛋白的基础琼脂，在4℃冰箱保存，1～2 d内用完；液体培养基庖肉葡萄糖培养基、含有氯化血红素、维生素K及半胱氨酸的脑心浸液及硫乙醇酸钠培养基，用前必须煮沸10 min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。

3.3 接种方法：做厌氧菌培养的标本应尽快接种培养基，最好床旁接种，尽快放置于厌氧环境，应同时接种2个血琼脂平皿，分别放置于有氧和5%～10% CO2环境中培养，以排除兼性厌氧菌，若厌氧培养有细菌生长但需氧培养不生长，则为厌氧菌。

3.4 培养方法：厌氧培养法有多种多样，常用的有厌氧罐法、气袋法和厌氧箱法。厌氧罐是普通的干燥罐，放入接种好的标本后，密闭厌氧罐，用理化方法造成厌氧环境；厌氧袋透明而不透气，内装有气体发生袋，放入标本后，尽量挤出袋内空气，打开后将内袋放入缸内，立即盖紧盖子，密封袋口；培养箱则通过透明玻璃面板上的两个手套在箱内进行操作，箱侧有一交换室，内门先关，先打开外门，放标本入箱内交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将接种物放入，关上内门，使箱内保持厌氧状态。

3.5 注意事项：大多数厌氧菌生长缓慢，一般在35℃培养48 h，如疑为放线菌则应延长72～96 h。如经48 h培养无菌生长，但涂片镜检阳性，应继续培养5～7 d。

4．特殊菌培养条件及培养基的选择

4.1 胞内寄生微生物：需采用组织培养，不能在无生命培养基或体外生长。

专性胞内寄生：所有病毒、衣原体、立克次体、考克斯体、埃立克体、麻风分枝杆菌、疟原虫和弓形虫。

兼性胞内寄生菌：李斯特菌、分枝杆菌、组织胞浆菌和布鲁菌。

非胞内寄生但不能常规培养：专性厌氧菌如厌氧芽孢梭菌、放线菌；微需氧的弯曲菌属和螺杆菌属；专性需氧的结核分枝杆菌、假单胞菌属和需氧芽孢杆菌。

4.2 细菌与选择培养基（表11-21）

表11-21　细菌与选择培养基