微生物涂片镜检操作规程

1．目的

涂片直接镜检或染色镜检，可以对标本的特征给以初步判断，作出快速的初步判断，以便为临床提供快速诊断信息。

2．设备性能参数

见显微镜、离心机使用操作规程。

3．标本采集

见标本采集及处理程序

4．操作步骤

微生物涂片镜检是最常用的微生物鉴定方法，可以是试验标本的直接镜检或染色镜检或经培养细菌的染色检查；用特殊的染色可以将微生物从形态学或功能上大体区分，常用的染色方法及特性见表11-18。

表11-18　常见涂片染色及特点

4.1 涂片直接镜检

4.1.1 动力和制动试验　适用于急性弧菌性腹泻患者的快速诊断。

原理：根据霍乱弧菌运动极为活泼的特性。

检测方法：取1滴急性期患者的水样便滴在玻片上，暗视野显微镜直接镜检，可见具有流星样动力的细菌，当加入1滴O1群或O139群霍乱免疫血清后，运动停止，凝集成块，而加入盐水无制动反应，可以初步报告疑似霍乱弧菌。

4.1.2 涂片找真菌　血液、脑脊液、胸腔积液、腹水及尿液离心（3 000r/min，10～15 min）后，在生物安全柜内，取洁净载玻片一张（在酒精灯火焰过2～3次），取沉淀物置于玻片上，加盖玻片后用高倍镜观察，如发现真菌孢子或菌丝，即可作出初步报告。在生物安全柜内，取洁净载玻片一张（在酒精灯火焰过2～3次），痰液于载玻片中央加一滴10% KOH，挑取脓痰带血丝的可疑部分或涂抹于10% KOH中，大便标本则于载玻片中央加一滴生理盐水，取绿豆粒大小粪便涂抹于生理盐水中，盖上盖玻片，置于高倍显微镜下镜检，如发现真菌孢子或菌丝，即可作出初步报告。

血液、胸腔积液、腹水、脑脊液等无菌部位检出真菌孢子及菌丝诊断真菌感染；大便、痰液中检出真菌孢子及菌丝需要结合临床诊断。

4.2 涂片革兰染色操作规程

4.2.1 原理　革兰阳性菌细胞壁的结构较致密，肽聚糖层厚，含脂质少，乙醇不易进入，因此，染料和碘的复合物不易为乙醇所渗出。革兰阴性菌细胞壁的结构疏松，肽聚糖层薄、含有大量脂质，乙醇易渗入而脱色。若革兰阳性菌细胞壁缺损，其染色性可变为阴性。革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，易和结晶紫-碘复合物结合而不易脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。革兰阳性菌等电点在pH 2～3，比阴性菌（pH 4～5）为低。在相同pH条件下，革兰阳性菌所带阴电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色。

4.2.2 设备和试剂

4.2.2.1 试剂名称：革兰染色液、生理盐水、甲醇、香柏油。

4.2.2.2 试剂盒组成

第一液：草酸盐结晶紫

第二液：改良卢戈碘液

第三液：脱色剂（95%酒精）

第四液：复红

4.2.2.3 设备：奥林巴斯双目显微镜、玻片、酒精灯。

4.2.3 操作步骤

4.2.3.1 涂片：于洁净载物玻片上滴加一小滴生理盐水，再用接种环挑取菌落少许，均匀涂布于盐水中；脓汁、痰、分泌物、菌液等直接涂片；脑脊液、胸腔积液、腹水等标本3 000 r/min离心10～15 min。弃上清取沉渣涂片。

4.2.3.2 固定　多采用加热法，涂片膜向上以中等速度通过火焰数次（温度不可过高）。脑脊液标本需用甲醇固定。固定的目的是在于保持细菌原有形态和结构，杀死细菌，并使染料易于着色。另外使细菌附着于载物玻片上，而不易被水冲掉。

4.2.3.3 染色

初染：将结晶紫染液加于制好的涂片上，染色l min，用细流水冲洗，甩去积水。

媒染：加卢戈碘液作用l min，用细流水冲洗，甩去积水。

脱色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约0.5 min），用细流水冲洗，甩去积水。

复染：加复红复染0.5 min，用细流水冲洗，甩去积水。

镜检：待标本片自干或用吸水纸吸干后，在涂片上滴加镜油，置油镜下检查。

4.2.4 质量控制　在同一载玻片上，每天需用金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和大肠埃希菌标准菌株ATCC25922作革兰阳性和阴性质控对照，每次质控与标本同步进行。如果失控，立即查明原因，重新染色，如果不能解决，与生产商联系更换试剂。

4.2.5 结果报告　根据细菌形态，可初步提示感染细菌的种类,革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。并注意观察细菌的形态和排列状况（例如：球菌、杆菌、球杆菌、弧菌，链状、成双、葡萄状等）。检到革兰阴性、凹面相对的球菌，细菌位于细胞内或细胞外。此时可报告临床“找到革兰阴性双球菌，位于细胞内（外），形似脑膜炎奈瑟菌”；检到革兰阳性，菌体周围有明显荚膜双球菌，可报告“找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”；检到革兰阴性，多形态，菌体大小不一，有杆状或丝状的菌体，可报告“找到革兰阴性杆菌，形似流感嗜血杆菌”；检到小的，规则的革兰阳性杆菌，单独或呈V形排列，出现于多量单核细胞之间者，可报告“找到革兰阳性球（杆）菌，形似产单核细胞李斯特菌”；检到上述以外的其他细菌，可报告“找到革兰阳（阴）性球（杆）菌”；检到革兰阳性孢子或菌丝，可报告“找到真菌孢子和（或）菌丝”。

4.2.6 干扰因素　脱色时间要根据涂片的薄厚来掌握，涂片厚的，脱色时间可稍长，反之，则时间稍短；固定不宜过热，脱色不宜过度，否则，阳性菌易染成阴性，且细菌易变形。

4.3 涂片抗酸染色操作规程

4.3.1 检验原理　结核杆菌、麻风杆菌等抗酸性菌，细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。

4.3.2 设备和试剂

4.3.2.1 试剂名称：结核菌染色液、BASO溶痰剂、生理盐水。

4.3.2.2 试剂盒组成

试剂1：石炭酸复红液

试剂2：酸性酒精溶液

试剂3：亚甲基蓝溶液

4.3.2.3 设备：OLYMPAS双目显微镜、B120医用低速离心机、载玻片、盖玻片、酒精灯。

4.3.3 操作步骤

4.3.3.1 制备涂片：可采用直接涂片和集菌涂片，后者包括沉淀法和漂浮法。通常用沉淀法，即将BASO溶痰剂与痰样本依2∶1或3∶1的比例加入，并用吸管以连续“吸放”的方式混合均匀（5～10 s），或混合均匀，静置室温10～20 min，待样本中黏液完全液化，3 000 r/min离心30 min，取沉淀物进行涂片；对于胸腹水、脑脊液和中段尿等标本，直接3 000 r/min离心30 min，取沉淀物进行涂片；漂浮法是将标本用生理盐水充分稀释，再加入汽油或二甲苯0.5～1 ml震荡15～30 min后，吸取泡沫和油层界面部分涂片。

4.3.3.2 固定：痰涂片、胸腹水、中段尿、脑脊液等涂片可在酒精灯火焰过火三次进行固定，也可用甲醇固定。

4.3.3.3 染色

初染：涂片经固定后，加石炭酸复红液染色5 min或更久。水洗（之后尽可能将水沥干）。

脱色：加酸性酒精溶液，脱色1～2 min。水洗（假如标本面还可以看到残存红色时，再加酸性酒精溶液脱掉红色为止）。

复染：加亚甲基蓝溶液染色30 s，水洗，干燥。

镜检：涂片干燥后，滴加镜油放在高倍镜下镜检。

4.3.4 质量控制

室间质评：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：室内人员比对、抗酸染色液质控。同时选择4份标本，标本1、2为抗酸染色阳性的痰标本，标本3、4为抗酸染色阴性的痰标本，本实验室内人员比对；本实验室和其他三级甲等医院临检中心实验室人员比对，并记录。抗酸染色液每次用已知分枝杆菌质控，如果失控，立即查明原因，重新染色，如果不能解决，与生产商联系更换试剂；抗酸染色液质控不应与标本在同一张玻片上,以免相互污染,造成假阳性。

4.3.5 结果报告　分枝杆菌呈红色，杂菌和背景物呈蓝色。结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列；结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本检测中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰阳性的短杆状、球状颗粒。

表11-19　结核杆菌检查

4.3.6 干扰因素　为提高阳性检出率，痰液应作集菌处理；每一玻片只能涂一份标本，禁止将两份或两份以上的标本涂在同一张载玻片上，以免染色过程中因冲洗使菌体脱落，造成阴性或阳性混淆；脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色为止；结核痰涂片镜检时，应按顺序查300个以上视野。

4.4 涂片墨汁染色操作规程

4.4.1 原理　墨汁与活体标本接触时，由于染料带负电荷与活体标本表面所带电荷性相似，故不具亲和力，不能将菌体着色。而已着色的背景在显微镜下可衬托出透亮无色的菌体和荚膜的形态。

4.4.2 设备和试剂

4.4.2.1 名称：印度墨汁染色液、生理盐水。

4.4.2.2 设备 ：OLYMPUS双目显微镜、B120医用低速离心机、载玻片、盖玻片。

4.4.3 操作步骤

4.4.3.1 脑脊液置于无菌管中，离心10～15 min（3 000 r/min）

4.4.3.2 用接种环取1环离心沉淀物置洁净玻片上。

4.4.3.3 取一接种环印度墨汁与玻片上的脑脊液混匀。

4.4.3.4 盖上盖玻片，镜检。

4.4.4 质量控制

室间质评：参加北京市临检中心和卫生部临检中心组织的质量控制活动。

室内质控：室内人员比对。标本1为墨汁染色阳性的脑脊液标本，标本2为墨汁染色阴性的脑脊液标本，本实验室内人员比对；本实验室和其他三级甲等医院临检中心实验室人员比对，并记录。每批印度墨汁用已知新型隐球菌质控，如果失控，立即查明原因，重新染色，如果不能解决，与生产商联系更换试剂。

4.4.5 结果报告　新型隐球菌可见菌体周围宽阔、透亮的厚膜，背景为黑色，似一晕轮，有时出芽，可报告“找到新型隐球菌”。新型隐球菌，特别是荚膜狭窄者易与白细胞相混淆，可用0.1%甲苯胺蓝染色法加以区别，新型隐球菌的菌体呈红色圆球状，荚膜不着色，白细胞染色成深蓝色。

4.4.6 干扰因素　菌液浓度与染液比例要适当；采用墨汁法要避免将高度电解物质（如酸类）与其接触，因它能使墨汁中胶体聚集，产生堆积沉淀现象，影响观察效果；用载玻片与盖玻片之间存有液体的湿片观察标本时，应防止液体外溢，必要时用蜡或凡士林封严四周；载玻片与盖玻片之间不应产生气泡，否则影响观察结果。

5．结果报告步骤

5.1 检验结果的输入　检验申请单编号每天从规定起始号开始进行编号，对应于涂片标本就应编同样的编号。编号完毕再对全部检验申请单进行复查，确认无误后输入结果。

5.2 对于有条形码的申请单，直接扫条码，方法为：双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入报告人口令及密码，回车确定即可进入，进入后，单击“细菌报告”，到指定编号位，按键盘的F3键，扫描条码即可。

5.3 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，结果即可录入。

5.4 对于无条形码的申请单，双击桌面的LIS图标（黄色小鱼）输入发报告者操作号及密码，回车确定，进入后，单击，进入后到指定编号位，在左边框内，依次按照姓名，性别，年龄，申请科室等键入，之后单击上边框的“直接记账”，找到收费项目双击。

5.5 结果录入，在预输入结果位置，单击右边框的“快速输入”，双击即可录入结果。

5.6 检验结果的确认

检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人及授权人员进行核对确认，无误即可发送。方法为单击细菌报告栏中的“发送”，弹出对话框，输入发送人（审核人）的口令密码即可，或单击“批量打印”，“审核发送”。

输入发送人（审核人）的口令密码，发送成功后单击退出。

6．报告时间

涂片直接镜检结果半小时内发出，涂片染色结果两小时内发出。

7．细菌镜检的参考指标

7.1 镜下微生物直径的比较：腺病毒0.10μm；疱疹病毒0.18μm；0.22μm；大肠埃希菌0.5μm×1.0μm；金黄色葡萄球菌0.8～1.25μm；流感嗜血杆菌0.2μm× 0.8μm；炭疽芽孢杆菌1.0μm×3.0μm；真菌菌丝：3μm（有隔菌丝）～8μm（无隔菌丝）；酵母菌3μm（组织胞浆菌）～20μm（隐球菌）；红细胞：7～8μm；蠕虫卵：16～80μm；蠕虫300μm以上。

7.2 弱革兰染色或非革兰染色细菌：专性细胞内寄生菌的衣原体、立克次体、考克斯体、埃立克体、巴尔通体、支原体、脲原体；弱革兰阴性菌的军团菌。

7.3 抗酸染色菌：抗酸分枝杆菌、诺卡菌、隐孢子虫卵囊。

8．安全性预警措施

见《生物安全手册》。

9．参考文献

[1] 周庭银，赵虎．临床微生物学诊断与图解．上海：上海科学技术出版社，

2001．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京 ：东南大学出版社，

2006．

[3] 倪语星，尚红．临床微生物学与检验．4版．北京：人民卫生出版社，2007．