1．荧光现象 化学物质吸收并储存外界能量（如光能、化学能）进入激发态后，在极短时间内从激发态回复到基态时，会以电磁辐射方式释放过剩能量，此能量可转化为相应波长的光，即荧光。荧光的波长大于激发光的波长。
2．相关参数
（1）发射光谱：即荧光分子的荧光光谱，指用固定波长的激发光激发样品时，检测仪器用不同检测光波长检测到的样品发射荧光的相对强度。
（2）激发光谱：即荧光分子的吸收光谱，指用不同波长的激发光激发样品时，检测仪器用固定检测光波长检测到的相应荧光发射强度。
（3）荧光效率：是荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，计算公式：
荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
（4）荧光寿命：指荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。
（5）荧光的淬灭：指在受到激发光较长时间照射后，荧光物质的荧光辐射能力发生减弱的现象。
3．荧光物质
（1）荧光色素：荧光色素（染料）是能产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物。常用的荧光色素有：
①异硫氰酸荧光素（FITC）：FITC应用最广，发出明亮的黄绿色荧光，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm。
②四乙基罗丹明（RB200）：呈橘红色荧光，最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm。
③四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：呈橙红色荧光，最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm。TRITC的荧光颜色与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配对用于对比染色或用于两种颜色的荧光抗体的双重染色。
④藻红蛋白（PE）：呈明亮的橙色荧光。常用B－藻红蛋白（BPE）和R－藻红蛋白（R－PE）。
B－PE的最大吸收光波长为546／565nm，最大发射光波长为575nm；R－PE的最大吸收光波范围在490～565nm，最大发射光波长为578nm。R－PE在488nm处光吸收率为565nm处的75%，说明PE与FITC可有效共用488nm激发光。利用这一特性，且R－PE的荧光颜色与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，所以R－PE与FITC可用于对抗体或配体双标记。
（2）其他荧光物质
①酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如β－半乳糖苷酶可催化4－甲基伞酮－β－D半乳糖苷分解成4－甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。
②镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3＋）、铽（Tb3＋）、铈（Ce3＋）等的螯合物，经激发后也可发射特征性的荧光。其中，Eu3＋螯合物由于激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定，是应用最广泛的金属元素。
4．荧光抗体的制备和鉴定
（1）抗体的荧光素标记
①抗体要求：特异性高及亲和力高，经纯化后不应含有针对标本中正常组织的抗体。
②荧光素要求：具有能与待标记蛋白质分子稳定形成共价键的化学基团；与抗体（或抗原）结合后不影响其特异性结合；荧光效率高，蛋白质标记的荧光素需要量少；荧光色泽与组织的背景色泽对比鲜明；标记方法简单、安全无毒、易于保存。
③蛋白质荧光标记方法常用搅拌法和透析法。
④标记抗体纯化：去除游离荧光素常用透析法或凝胶柱层析法，去除过多结合荧光素的抗体常用离子交换层析法。
（2）荧光抗体鉴定
①抗体效价常用双向琼脂扩散法进行滴定，效价＞1∶16者较为理想。
②测定荧光素与蛋白质结合比率（F／P）：将荧光抗体稀释至A280≈1．0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。
F／P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多。一般用于固定标本的荧光抗体以F／P＝1．5为宜，用于活细胞染色的以F／P＝2．4为宜。
③确定抗体工作浓度：将荧光抗体自1∶4～1∶256倍比稀释，分别对切片标本做荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光，且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。
5．免疫荧光显微技术
（1）标本的制作
①常见临床标本主要有组织、细胞（包括单层细胞培养）和细菌三大类。
②制作方法：细胞或细菌可制成涂片，组织标本可制作成切片（厚度≤10μm）或印片。
（2）荧光抗体染色
①染色一般步骤：在已固定标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，一般在25～37℃温度下温育30min；不耐热抗原以4℃过夜为宜。用PBS充分洗涤，干燥。
②染色方法：a．直接法，将荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。主要优点是特异性高，非特异荧光染色因素少。b．间接法，既可检测未知抗原，也可检测未知抗体。检测未知抗原：先将针对抗原的特异诊断抗体（第一抗体，IgG）直接滴加于标本上，作用后洗涤，再加针对第一抗体的荧光抗体（第二抗体，动物抗人IgG－Ab）。检测未知抗体：将待测血清（第一抗体）加在已知抗原标本片上，作用后洗涤，再加针对第一抗体的荧光抗体。本法敏感性高于直接法，而且在检测不同抗原时只需应用一种荧光抗体。c．双标记法：对同一标本，用FITC与罗丹明（或藻红蛋白）分别标记不同的抗体做荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光色泽。d．补体结合法，在加第一抗体的同时也加入补体，抗体与抗原特异性结合后可固定补体，再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。本法只需一种抗体，且敏感度高，但易出现非特异性染色。
（3）荧光显微镜检查：经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即做镜检，以防荧光消退，影响结果。
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