蛋白质质谱分析

时间：2022-03-13 理论教育版权反馈

【摘要】：目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。当前市面上出售的质谱仪MALDI源多与飞行时间质量分析器匹配联用，而ESI源多与四极杆、离子阱质量分析器联用。空间串联是两个以上的质量分析器联合使用，两个分析器间有1个碰撞活化室，目的是将前级质谱仪选定的离子打碎，由后一级质谱仪分析。得到的质谱主要是分子离子，准分子离子。

质谱（mass　spectrum，MS），从字意表明，就是按照质量大小顺序排列所成的谱。按离子质量数m与电荷数z的比值（称质荷比m／z）大小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或原子质量，即物质粒子的质量谱。

质谱分析法是按照离子的质荷比（m／z）大小对离子进行分离和测定，从而对样品进行定性和定量分析的一种方法。1912年J．J．Thomson发明了第一台质谱装置。早期的质谱仪主要是用来进行放射性核素测定和无机元素分析。20世纪40年代有机质谱诞生，开始用于有机物分析。60年代出现了气相色谱－质谱联用仪，使质谱仪的应用领域大大扩展，进入混合物分析阶段。计算机的应用又使质谱分析法发生了飞跃变化，使其技术更加成熟，使用更加方便。80年代以后又出现了一些新的质谱技术，如快原子轰击电离子源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源，以及随之而来的比较成熟的液相色谱－质谱联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，傅立叶变换质谱仪等。这些新的电离技术和新的质谱仪使质谱分析又取得了长足进展。目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。

生物质谱出现于20世纪80年代末，使质谱仪的应用又发生了一次飞跃。1988年约翰·芬恩发明了电喷雾电离质谱（ESI－MS），同一年田中耕一发明了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS），开始分析生物大分子。以往的有机质谱是有机小分子结构分析的重要工具，但一直不能用于分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸等。这是由于有机质谱仪有限的质量范围和电离技术不适合热不稳定、挥发性差的生物大分子的测定。而电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离这两项新的“软电离”技术的出现，使得分析生物大分子成为可能。生物质谱给生命科学研究带来的影响是革命性的。

【基本原理】

1．质谱仪构成　质谱仪一般由四部分组成。

（1）进样系统：按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位。

（2）离子源：用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束。

（3）质量分析器：利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离。

（4）检测器：用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。

2．质谱仪各系统的工作

（1）进样系统：一般情况下，进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源（10－6～10－8　mmHg），离子化后由质量分析器分离再检测；计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据，并可将质谱图与数据库中的谱图进行比较。

（2）离子源和质量分析器：是两个关键部件，不同种类的质谱仪通常也是根据这两者来命名的。生物质谱仪的离子源一般有两种：电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）。而质量分析器主要有四极杆分析器（quadrupole　analyzer）、飞行时间质量分析器（time of　flight　analyzer，TOF）、离子阱质量分析器（Ion　trap　analyzer，IT）。当前市面上出售的质谱仪MALDI源多与飞行时间质量分析器匹配联用，而ESI源多与四极杆、离子阱质量分析器联用。生物质谱的软电离技术基本上都只有准分子离子，没有结构信息，更需要串联质谱法得到结构信息。因此，近年来，串联质谱发展十分迅速。串联质谱法可以分为两类：空间串联和时间串联。空间串联是两个以上的质量分析器联合使用，两个分析器间有1个碰撞活化室，目的是将前级质谱仪选定的离子打碎，由后一级质谱仪分析。而时间串联质谱仪只有1个分析器，前一时刻选定离子，在分析器内打碎后，后一时刻再进行分析。常见的串联质谱如MALDITOF－TOF就是两个TOF质量分析器串联，ESI－Q－TOF就是四极杆与TOF质量分析器串联，而ESI－IT的离子阱质量分析器则属于时间串联。

3．ESI和MALDI离子源　离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。常见的离子化方式有两种：一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化，另一种为从固体表面或溶液中溅射出带电离子。在很多情况下进样和离子化同时进行。这里简要介绍生物质谱常用的ESI和MALDI离子源的原理。

（1）MALDI离子源：是利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离。被分析的样品置于涂有基质的样品靶上，激光照射到样品靶上，基质分子吸收激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。激光电离源需要有合适的基质才能得到较好的离子产率。因此，这种电离源通常称为基质辅助激光解吸电离（matrix　assisted　laser　description　ionization，MALDI）。MALDI特别适合于飞行时间质量分析器（TOF），组成MALDI－TOF。MALDI属于软电离技术，它比较适合于分析生物大分子，如肽、蛋白质、核酸等。得到的质谱主要是分子离子，准分子离子。碎片离子和多电荷离子较少。MALDI常用的基质有2，5－二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、α－氰基－4－羟基肉桂酸等。

（2）ESI离子源：在毛细管的出口处施加一高电压所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。ESI的最大特点是容易形成多电荷离子，使质量电荷比（m／z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。目前的纳升电喷雾源（nanoESI）不仅提高了分析灵敏度，而且少至0．5μl样品溶液，可得到30多分钟的稳定喷雾。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液－质联用（LC－MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。

4．常见质量分析器

（1）四极杆质量分析器：因其由四根平行的棒状电极组成而得名。相向的一对圆棒施加电极相反的直流和交流电压，当离子漂移通过四极杆的中间区域时，改变四极杆上施加的电压，使具有特定质荷比的离子才能通过，所有其他质荷比的离子改变线性飞行路径，从分析器中消失。如果四极杆上施加的电压连续变化（扫描），由通道－电子倍增器记录通过滤质器的离子数，并与特定离子的质荷比建立函数关系，就得到一张质谱图。

（2）离子阱质量分析器：由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），通过施加适当电压就可以形成1个势能阱（离子阱）。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱（MSn）的功能。

（3）飞行时间质量分析器：具有相同动能、不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。

【研究应用】　随着质谱技术的不断改进和完善，尤其是生物质谱的出现，使得质谱的应用范围扩展到生命科学研究的许多领域，尤其是在蛋白质、核酸等领域的应用为生命科学研究提供了新方法。这里重点介绍生物质谱技术的应用。

1．蛋白质鉴定　蛋白质类生物大分子分子量的测定有着十分重要的意义。常规的分子量测定主要有渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。这些方法存在样品消耗量大，精确度低易受蛋白质的形状影响等缺点。MALDI－MS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用，不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，还可直接用来测定蛋白质混合物的分子量，也能被用来测定经酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序列。

随着质谱技术的发展，通过串联质谱测定蛋白质的多肽序列，并搜索数据库成为高通量鉴定蛋白质的新方法，用真实谱—理论谱联配的方法对串联质谱得到多肽图谱进行从头解析。

2．蛋白质组研究　蛋白质组是指1个基因组、1个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术是蛋白质组研究的三大支撑技术之一。研究显示，肽指纹谱的方法比氨基酸组成分析更为可靠，这是因为MALDI测定肽质量的准确度为99．9%，而氨基酸组成分析的准确度仅为90%。另外MALDI可以耐受少量杂质的存在，对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的，它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，通过推断肽片的断裂，即可导出肽序列。

3．核酸研究　ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了有力的方法，它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3＇或5＇端进行部分降解，在不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量，将其与4个脱氧核苷酸的标准分子量进行对照，就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题，使得其更适合于碱基数较少的短链核酸的分析。

4．糖蛋白分析　糖生物分子的研究由于其糖链的复杂性给糖蛋白的结构分析带来了很大困难。但随着质谱新方法和新技术的发展，糖蛋白的研究近几年有了突破性的进展。采用液相色谱－电喷雾质谱结合蛋白酶解和糖苷酶解的方法为糖蛋白的分析提供了快速、灵敏的检测手段。通常对蛋白上糖链的结构分析需将糖链切割下来并回收，再进行色谱分析或质谱分析。通过将糖苷酶处理前后的糖蛋白酶解肽谱可确定糖肽的位置，糖结合位点，并通过串联质谱分析糖肽上所连糖链的结构。

5．微生物鉴定　微生物检验的重点主要在于微生物的分类鉴定上。在对微生物全细胞蛋白成分的鉴定上，可用质谱对裂解细胞直接检测，测定其全细胞指纹谱，找出种间和株间特异保守峰作为生物标志，以此来进行识别。细菌鉴定的另一个主要方法是细菌的脂肪酸图，即细菌脂类水解后释放出脂肪酸，将这些脂肪酸甲基化后分离检测所得到的图谱。

【鉴定方法】　目前，生物质谱1个重要的应用是蛋白质组学研究中对分离的蛋白质进行鉴定。双向电泳是蛋白质组分离的主要技术。利用MALDI质谱技术可以对双向电泳胶上蛋白质点进行鉴定。鉴定蛋白质点一般需经过3个步骤：蛋白质胶内酶解、MALDI－TOF质谱检测、蛋白质数据库检索。由于生物质谱的应用范围很广，而且不同类型的质谱仪的操作方法也不尽相同，所以这部分重点介绍利用MALDI质谱鉴定双向电泳胶上蛋白质点的胶内酶解方法，相关的质谱仪的操作与检索步骤不做介绍。

1．蛋白质胶内酶解

（1）取点：沿边缘切取凝胶上的差异蛋白质点，置于1．5ml　EP管。

（2）水洗：1ml纯水清洗蛋白质点3次，每次10min。

（3）脱色：①脱色液［30mmol／L　K3Fe（CN）6与100mmol／L　Na2S2O3体积比1∶1混合］50μl，脱色2min；②水洗两次，至蛋白质点无色透明；③50μl　50%ACN脱水15min；④50μl 100%ACN脱水15min；⑤50μl　200mmol／L　NH4HCO3吸胀5min；⑥50μl　100%ACN脱水15min；⑦真空冷冻干燥1h。

（4）还原与烷基化：①50μl　10mmol／L　DTT（含100mmol／L　NH4HCO3），57℃还原1h；②50μl　55mmol／L碘乙酰胺（含100mmol／L　NH4HCO3），室温、暗处烷基化30min；③100μl　100 mmol／L　NH4HCO3冲洗两次，每次5min；④50μl　100%ACN脱水15min；⑤加入50μl　100 mmol／L　NH4HCO3，真空冷冻干燥1h。

（5）胶内酶切：①10μl　Trypsin与90μl酶解缓冲液混合，每个蛋白质点加入10μl上述混合液。冰上放置45min；②加入30μl覆盖液（9%ACN，40mmol／L　NH4HCO3）；③37℃酶解12～16h。

（6）萃取：①离心酶解EP管，吸取上清液至另一0．5ml　EP管；②两次萃取：每次加入30μl萃取液（50%ACN，2．5%TFA）至1．5ml　EP管，37℃萃取1h；③吸取两次的萃取液至上述0．5ml　EP管；④真空冷冻干燥约1h，至剩余液体5～10μl。得到肽混合物样品，以备质谱检测。

2．胶内酶解注意事项

（1）取点时边缘不要切取过多或过少。

（2）酶解过程所用水必须为纯水，以减少对质谱检测的影响。

（3）酶解全过程戴手套、口罩、帽子进行，避免角蛋白污染。

（李雪华）

参考文献

［1］O’Farrell　PH．High　resolution　two－dimensional　electrophoresis　of　proteins．J　Biol　Chem，1975，250（10）：4007－4021．

［2］Bjellqvist　B，Ek　K，Righetti　PG，et　al．Isoelectric　focusing　in　immobilized　pH　gradients：principle，methodology　and　some　applications．J　Biochem　Biophys　Methods，1982，6（4）：317－339．

［3］Grg　A，Postel　W，Günther　S．The　Current　State　of　Two－dimensional　Electrophoresis　with　Immobilized pH　Gradients．Electrophoresis，2000，21（6）：1037－1053．

［4］Aebersold　R，Mann，M．Mass　spectrometry－based　proteomics．Nature，2003，422，198－207．

［5］Alban　A，David　SO，Bjorkesten　L，et　al．A　novel　experimental　design　for　comparative　two－dimensional gel　analysis：two－dimensional　difference　gel　electrophoresis　incorporating　apooled　internal　standard．Pro－teomics，2003，3：36－44．

［6］Dowsey　AW，Dunn　M．J，Yang　GZ．The　role　of　bioinformatics　in　two－dimensional　gel　electrophoresis．Proteomics，2003，3：1567－1596．

［7］Fievet　J，Dillmann　C，lagniel　G，et　al．Assessing　factors　for　reliable　quantitative　proteomics　based　on　2－DE．Proteomics，2004，4：1939－1949．

［8］Shaw　MM，Riederer　BM．Sample　preparation　for　2－DE．Proteomics，2003：1408－1417．

［9］彭聪，谭琛，张秋红，等．新基因BRD7对鼻咽癌蛋白质表达谱影响的初步研究．生物化学与生物物理进展，2003，30（5）：721－725．

［10］王治东，陈肖华．2DE技术及其在辐射损伤研究中的应用．国外医学·放射医学核医学分册，2003，27（1）：45－48．

［11］夏其昌，曾嵘．蛋白质化学与蛋白质组学．北京：科学出版社，2004：144－166．

［12］Pennington　SR，Dunn　MJ（著），钱小红等译．蛋白质组学：从序列到功能．北京：科学出版社，2002：72－80．

［13］钱小红，贺福初．蛋白质组学：理论与方法．北京：科学出版社，2003：24－116．

［14］陈主初，梁宋平．肿瘤蛋白质组学．长沙：湖南科学技术出版社，2002：49－109．

［15］彭好益，李强．质谱技术在生物医学中的应用探析．技术与市场，2009，16（2）：11－12．

［16］张永乐，娄国强．生物质谱分析的研究进展及临床应用．生物医学工程学进展，2009，30（2）：103－105．

［17］张吉林，宋玉国．医学分子生物学实验指导．北京：中国医药科技出版社，2005：108－116．