克服桔梗自交不亲和性的方法

前一节中已经明确桔梗为广义自交不亲和植物，其雌、雄蕊发育异熟性和开花后柱头表面密被的柔毛，确保了同花花粉难以在自花柱头上萌发、进而完成授粉作用，这就大大降低了自交引起的后代群体生活力下降。但在植物育种、性状遗传分析等研究工作中，常常需要通过人工控制自花授粉，以获得遗传纯合的自交后代材料，这就有必要对克服桔梗自交不亲和方法进行研究，为桔梗育种及遗传分析等工作提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1　材料

研究材料为陕西省商州市境内的刘湾植物药园二年生桔梗居群，2005年3月播种，2006年4月移栽。

1.2　子房生长测定

进行自交的同时定株、定柱头测量自交果实和异交果实的生长发育情况。从授粉当天直至第9天，每天测定1次，每次测量10个子房。最后以授粉当天子房长、宽度为基数，计算子房累积生长量。

1.3　毛刷授粉辅助授粉后子房生长、结果率情况测定

花期在健壮单株上选择即将开放的花蕾100朵，套袋，开花后，先用镊子从花丝处夹断雄蕊，保存花药，用毛刷小心地刷去柱头表面的柔毛，然后用同花花粉授粉，套袋并挂牌标记;用相同的方法进行异花授粉，观察果实的生长，成熟后考种，计算结实率和亲和指数。使用过的毛刷，用75%酒精浸泡1 h，蒸馏水冲洗3次，晒干，方可再用。

1.4　人工授粉和结果统计

花期选择生长健壮植株600株，共选1200朵花套袋，分别于开花当日至花后5日，每日选择100朵花进行套袋自交，同时另选100朵花进行异花授粉，所用花粉均为当日新鲜花粉;授粉后套袋防止串粉，然后挂牌标记授粉花粉、授粉花朵数和授粉日期。授粉后10d去掉纸袋，成熟时自交处理和异交处理按授粉日期收获，考察计数每一花的结果数、每果的饱满粒数、瘪粒数和败育残迹，并计算结果率与亲和指数。

结果率=获得果实数/授粉花朵数×100%

亲和指数(结实率)=饱满种子数/授粉花朵数

1.5　花粉贮藏

将新鲜花粉均匀分为10份，其中5份不脱水，为正常花粉;另外5份放于45℃下的恒温干燥箱内脱水4 h。然后将两种处理的花粉装入经过高温灭菌的医用小瓶中，贴上标记，并分别在常温、10℃、4℃、-20℃、-50℃条件下保存。

1.6　花粉活力测定

取少量花粉置于单孔凹形载玻片上，加1～2滴TTC(氯化三苯基四氮唑)用牙签搅匀，盖上盖玻片，置于35℃恒温箱中显色15min，低倍镜观察，染为红色者为有生活力花粉。

2　结果与分析

2.1　贮藏温度和时间对桔梗花粉活力变化的影响

脱水干燥对花粉生活力的影响:桔梗花粉45℃脱水干燥4 h，花粉生活力明显下降。当日采集的新鲜桔梗花粉生活力为91.5%，脱水后生活力降低为79.0%，脱水过程花粉生活力下降13.67%。

贮藏时间对桔梗花粉活力的影响见表2-4-1，随贮藏时间的延长花粉生活力均明显下降，但不同温度下贮藏的花粉其生活力下降速度明显不同，其中以常温贮藏花粉生活力下降最快:正常花粉常温贮藏2d花粉生活力下降85.46%，贮藏3d花粉活力完全丧失;在常温条件下桔梗花粉只能保存2d，而-50℃条件下花粉贮藏90d其生活力下降60.00%，其活力下降速度明显比常温贮藏缓慢。

表2-4-1　贮藏时间和温度对桔梗花粉活力的影响(%)

2.2　毛刷授粉对子房的生长量的影响

授粉当日测量每个子房的长和宽，以此为基数计算子房授粉后1～9d的累积生长量。由表2-4-2可以看出，单株间异交与同花自交的子房生长量没有明显的差异，而毛刷授粉子房生长量明显高于直接人工授粉;同时可以看出，授粉后1～7d子房生长迅速，授粉8d后桔梗子房停止或接近停止生长。单株间异交1～9d的子房累积生长量为22.9mm，自交为22.3mm，两者仅相差2.69%;而毛刷授粉自交1～9d的子房累积生长量为48.6mm，直接授粉自交为22.3mm，前者比后者高出117.94%。表明开花当日的柱头用同花花粉授粉和株间异花授粉的子房生长量没有明显差别，且子房生长膨大速度都比较缓慢;而开花当天用毛刷刷去柱头表面的柔毛，在授粉的子房膨大速度明显加快。

表2-4-2　不同授粉方式的子房生长量比较(mm)

2.3　毛刷授粉对结实率的影响

由表2-4-2、表2-4-3可以看出:毛刷授粉自交的结果率和亲和指数与对照相比都明显升高，而均低于花后3d授粉，同时不同单株间异交与自交表现相同的情况。毛刷授粉自交50朵花，获得了35个果实，结果率70.0%，亲和指数36.63，分别比对照升高了1.92倍和11.21倍;而毛刷授粉比花后3d授粉的结果率和亲和指数分别低23.91%和48.90%(表2-4-3)。可见毛刷刷去柱头表面柔毛，明显促进花粉在开花当日柱头上的萌发生长。

表2-4-3　桔梗不同授粉方式的结果率和亲和指数

2.4　延迟授粉对结实率的影响

桔梗开花当日，不同单株异花授粉和自花授粉，亲和指数均很低(表2-4-4)，分别仅为2.78和3.00，结果率略高分别为20.0%和28.0%，但多数果实内仅有少数几粒种子或为空果。随着授粉延迟时间的推移，异花授粉和自花授粉的结果率和亲和指数均呈单峰曲线变化，即先均逐渐升高，花后3d授粉达到最大，之后开始下降。且在同一授粉时间，异花授粉和自花授粉结实率和亲和指数均很接近，二者间没有明显差异，表明花期桔梗柱头对异花花粉和自花花粉不具备选择效应，其柱头表面没有花粉萌发的选择抑制物质，据此桔梗开花当日授粉不亲和性是由柱头表面柔毛结构和雌雄蕊异熟共同作用的结果。

表2-4-4　桔梗自交和异交亲和性比较

3　讨论

低温保存是目前植物种质资源保存的较理想途径，低温贮藏可使大多数植物的花粉保持较长时间的生活力，低温贮藏的桔梗花粉可直接用于杂交育种的授粉，为进一步培育新品种奠定了坚实的基础。在室温、10℃、4℃、-20℃(脱水花粉)、-50℃条件下保存的桔梗花粉随贮藏天数的增加，花粉生活力均有所下降，但随着贮藏温度的降低花粉生活力下降速度明显减慢，贮藏时间明显延长。花粉细胞在低温或超低温环境中，细胞内的自由水被固化，仅剩下不能被利用的液态束缚水，酶促反应进行缓慢，新陈代谢不活跃，花粉细胞处于“休眠”状态，花粉贮藏时间也随之延长。

魏建和等对桔梗柱头对花粉的识别作用进行了剥蕾授粉研究，认为蕾期授粉不会提高桔梗结籽率。在本研究中:不同发育时期的桔梗柱头分别授以同株花粉和异株花粉，自交和异交的亲和指数变化趋势一致;且同一发育程度的柱头，授以自花花粉和异花花粉其亲和指数很接近。表明桔梗自花花粉和异花花粉具有同等的受精结实能力。

桔梗自交结实率低的原因:桔梗属于异花授粉植物，其天然自花结实率很低，很多人认为与柱头授粉率低、柱头上异化花粉量较少有关，魏建和等认为天然结实率低是雌雄蕊异熟和花粉寿命短造成的。我们观察到桔梗开花当天和花后1天，在其柱头上密被较长的白色柔毛，经显微观察此时花粉被柔毛阻隔，很难落到柱头表面，更无法从表面细胞吸收萌发和花粉管生长所需的水分和养分，密被在柱头上的柔毛，是桔梗自交结实率低的原因之一。

毛刷授粉提高自交结实率:开花当天用毛刷将覆盖在柱头表面的柔毛小心刷去，并授以自花花粉，其子房膨大速度和结实率都有较大提高，开花当日采用毛刷授粉可以获得较高的结实率。

4　结论

花粉在贮藏过程中生活力的变化受内外因素的影响，其中花粉含水量和贮藏温度是影响花粉活力的重要因素，桔梗花粉45℃脱水干燥4 h，花粉生活力明显下降，但干燥处理后的脱水花粉其耐贮藏性明显高于正常花粉;随着贮藏天数的增加桔梗花粉生活力逐渐下降，但10℃、4℃、-20℃(脱水花粉)、-50℃低温条件保存的桔梗花粉，随着贮藏温度的下降花粉生活力下降速度明显减慢，贮藏时间明显延长。桔梗开花后，亲和指数随柱头的发育，自花授粉和异花授粉其结实率表现相同变化规律，均呈单峰曲线变化，即开花当天授粉亲和指数很低为2.8，之后逐渐升高，花后3天授粉的亲和指数最高，达74.31，之后开始下降;且发育程度相同的柱头，自花授粉和异花授粉其结实率没有明显差异。延迟授粉和毛刷授粉可明显提高桔梗结实率和亲和指数，是克服桔梗人工授粉不结实的有效方法。