轴突传导动作电位时的机械活动

这项研究涉及的问题是，动作电位通过轴突时会引起它的微小肿胀，肿胀牵动了容积激活的阴离子通道，而这个阴离子通道的激活介导了ATP的非小泡释放。这里使我们感兴趣的是，动作电位在传导时伴有机械动作。

虽然神经元通信的基本机制是神经递质从突触小泡释放，而且脑内多数细胞并不以突触方式耦合到神经元，但这些细胞可以对神经回路的脉冲性活动作出反应。例如非神经元细胞包括髓鞘化神经胶质细胞、非髓鞘化神经胶质细胞、血管细胞、免疫细胞，它们对产生冲动活性的轴突进行反应，从而参与慢性疼痛，但是神经元并不与星状胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞、血管内皮细胞或免疫细胞发生突触连接［7］。

神经元信使在突触以外释放具有广泛的生物学意义，特别是考虑到轴突和胶质细胞之间的通信。下文将介绍轴突ATP的非突触、非小泡释放机制，此种ATP释放是当动作电位发放时，通过被微观轴突肿胀所激活的容积激活阴离子通道（volume-activated anion channel，VAAC）而释放的。研究ATP的动作电位诱导的非突触释放，应用了组合的方法，包括ATP释放的单光子成像、内源性光信号成像、细胞内钙离子成像、延时视频以及共聚焦显微镜等。实验表明，应用巴弗洛霉素（bafilomycin）和肉毒杆菌毒素（botulinum toxin）阻断小泡释放后，ATP可以从培养的胚胎DRG轴突释放；而用药理学方法抑制VAAC或阻断动作电位诱导的轴突肿胀，从而阻断轴突和胶质细胞之间的活性依赖的信号传送，可以抑制ATP的释放。所以，这是一种非小泡、非突触通信，可能介导轴突和神经系统细胞之间在正常条件下的发育，以及在疾病条件下不同形式的活性依赖的相互作用［7］。

ATP是神经元之间及神经元和非神经元之间进行活性依赖的相互作用的主要细胞间信息分子。有研究显示，ATP从发放动作电位的神经元释放，不仅在突触部位，也沿着轴突表面，不论在中枢或周围神经系统中都有这种情况。轴突的非突触释放机制尚不清楚，通过用钙成像方法分析游离神经段，曾经展示，去除细胞外钙可以抑制活性依赖的轴突-胶质细胞通信，提示ATP是由神经小泡释放的，但在游离神经段中突触是稀少的，甚至是缺失的［7］。

ATP可以从不同的非兴奋性细胞，通过非小泡机制释放，包括从缝隙连接的、具有足够大直径孔的半通道和离子通道释放，如嘌呤受体P2X7，以及通过囊性纤维化跨膜电导调节蛋白（CFTR）通道释放。但是没有证据表明，这些ATP释放的通路是被轴突动作电位的放电所激活的［7］。

通过机械刺激而产生的液体剪切力（shear force）或细胞膜的微小位移，可以触发ATP从电不可兴奋的细胞释放，包括血管细胞、肺细胞、膀胱细胞和胶质细胞，这部分地是通过细胞膜上的氯通道，因为VAAC通道被膜的牵拉所激活。当细胞经过低渗处理而肿胀以后，上述通道中的某些通道对ATP4-及MgATP2-通透，ATP4-及MgATP2-可以与水一起释放出来，以恢复正常的细胞容积。关于氯通道的分类，目前还没有推荐的官方命名学。VAAC包括最大阴离子通道、容积调节离子通道（volume-regulated ion channel，VRAC）［也称为容积敏感的有机渗透物阴离子通道（volume-sensitive organic osmolyte-anion channel，VSOAC）、容积调节通道（volume-regulated channel，VRC）、容积扩张敏感通道（volume expansion-sensing channel，VSOR）］。VAAC的分子鉴定还没有做出来，它可能代表各种不同的氯离子通道，其激活是由于细胞肿胀，而且不同程度地表达于不同的细胞。属于9成员CIC基因家族的基因，编码了某些蛋白质，这些蛋白质是：电压门控Cl-通道、Cl--H+交换蛋白、电压依赖的阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）。这些蛋白质曾经被认为功能性地关联于VRAC；其他蛋白质包括斑萎蛋白（bestrophin）和anoctamin，也可能参与其中［7］。

某些VAAC可以通过药理学阻断而得到鉴定。最大的阴离子通道可以通过VAAC对Gd3+（钆，gadolinium，第64号元素，符号Gd）和DIDS（4，4′-diisothiocyano-stilbene-2，2′-disulfonic）、NPPB［5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）-benzoate］化合物的敏感性，以及对根皮素（phloretin）的不敏感性而得到鉴定。VAAC具有大的单通道电导，为300～400 pS；孔直径为1.3 nm，允许细胞间的有机小分子阴离子流动，包括谷氨酸（直径0.35 nm）、ATP（直径0.6 nm）。最大的阴离子通道是ATP释放的一条显著通路，负责胶质细胞和其他细胞对肿胀或缺血后果作出反应。VDAC1基因曾经被提议为最大阴离子通道基因，但是有争论［7］。

机械刺激神经元被用来实验性地诱发ATP释放。这支持一种假说，就是牵拉调节的通道可能提供一条通路，以便轴突的非小泡性ATP释放，然而存在于轴突的VRC是否可以作为对电刺激的反应而被激活，还不清楚［7］。

鉴定介导ATP从神经元释放的分子机制，具有复杂性，因为神经组织含有许多类型的细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、胶质细胞，这些都可以参与ATP的释放。为了绕开这个问题，研究者应用了特异细胞培养系统，用小鼠背根神经节（DRG）来研究轴突的ATP释放（图9-5A）。研究者采用的是多区隔细胞培养小室，把神经元的胞体和轴突分隔在分别的液体密闭区隔内。实验安排还提供条件，可以在培养皿中通过白金电极刺激轴突，引起动作电位发放。选择DRG神经元用于这种分析，是因为它们没有树突，也不和其他DRG神经元形成突触（自家突触），不论在活体上或被单独培养。实验结果表明（图9-5），当DRG神经元在这样的小室里与雪旺细胞、星状胶质细胞共培养时，轴突动作电位刺激了这些胶质细胞的钙反应，部分地是通过活性依赖的、从轴突释放的ATP。ATP激活胶质细胞上的嘌呤能受体。此活性依赖的轴突-胶质细胞信号传送，引起胶质细胞基因表达的变化，允许脉冲活动可以调节细胞的增殖分化及髓鞘化等功能。这种相关信号的应用，被认为在调节神经元和胶质细胞发育中是重要的，但其中的ATP释放机制还不清楚［7］。

图9-5　ATP从发放动作电位的轴突释放（彩图见图版此处）

（A）小鼠DRG神经元细胞体（b）和轴突（a）被分隔开来，摆放到多区隔培养小室，允许生长在高电阻分隔区隔之间的轴突接受培养皿盖子上的白金电极的电刺激（箭头）。（B）培养基中加入虫荧光素（luciferin）和荧光素酶（luciferase）后，神经元释放的ATP可以用单光子成像方法加以检测，其原理是用发光测定法分析培养基样品中的ATP浓度。释放的ATP被检测为单个光子（红的点），它由ATP依赖的化学发光反应所产生。在时间系列上的每个图像展示1s内积累起来的光子数目，然后把它们叠加到亮视野的轴突图像上。经与标准溶液校正后，光子计数提供了ATP浓度的定量测定指标。（C）同一轴突可以反复诱导ATP的释放，10 Hz刺激的开始和时程分别用黑横杠（1和5 min）与箭头（10 s）表示。（D）60 s、10 Hz的（红圆圈）刺激经过7 min后，ATP浓度恢复到与刺激前没有明显差别的水平（P＞0.05，n＝11）。（E）为了得到ATP的释放，并不需要长时间的刺激；通过1 min的10 Hz刺激可以接近ATP的最大浓度（n＝48，用发光测定法测定）。（F）低频率刺激对释放ATP是有效的，当频率在1～10 Hz（n＝61）之间时。ATP释放与刺激频率成比例（在E和F中，在大体培养液里用发光测定法测得的ATP浓度，比B和D中贴近细胞用单光子成像显微术测得的ATP浓度低大约40倍）。标尺横杠：1 mm（A）；10 μm［（Ab）和（B）］。（图引自［7］）

在早期的神经纤维电兴奋研究中，已经观察到轴突的物理特征变化。在动作电位放电期间，这些变化紧密地跟随着电压波动。这些变化包括：轴突快速变热和变冷，轴突膜的微小机械位移，通过轴突的光传送改变等。光传送及膜位移的快速变化，显然是由伴随着动作电位而来的跨膜离子流动（可能是Ca2+）及水流动所引起的。这一变动曾被建议可以引起小的容积变化。因此，作为对一串动作电位的反应，轴突可以肿胀，肿胀来自积累起来的跨越细胞膜的离子注入及水分子重新分布。如果轴突的动作电位放电所引起的细胞容积变化，足够激活VAAC，就可能提供一个机制，可以说明神经元活性依赖的ATP释放是非突触、非小泡的。的确，非小泡的、活性依赖的ATP释放，比之突触传送信号，可能在神经系统的细胞-细胞信号传送方面具有广泛的功能。这是神经回路中一种独特而特异的、快速的（毫秒级的）串联传送。本章的目标是希望确定：与轴突的脉冲性动作电位相关联的轴突肿胀及其位移，这些变化是否足以激活VAAC，使它释放ATP，从而介导轴突和胶质细胞之间活性依赖的通信？［7］

在完整神经中电诱导的ATP释放，已经在几个研究里得到展示。另有具体的实验证实了这种释放。例如，测定出来的结果是：10 Hz的1～5 min刺激，引起浸浴大鼠视神经的生理盐水溶液中ATP浓度增加9.3±0.42 pmol/L（n＝2），引起脊髓背根神经的ATP浓度增加86 pmol/L（n＝1），引起坐骨神经的ATP浓度增加53.7±16.4 pmol/L（n＝4）［7］。