图像的形成

图5-4通过透射光成像的生物显微镜的光学布置来说明DIC图像形成的原理，该原理与反射光成像的金相显微镜是相同的。入射的线偏振光被DIC棱镜分裂成一对相隔距离很小的O光线和E光线。两束光线的电场矢量在相互垂直的平面内振动。这对光线的传播维持相互平行，它们相隔距离为0.2～2μm的剪切距离（shear distance），该距离相当于或小于物镜的空间分辨率。事实上，随切变距离减小，分辨率提高，切变距离可减小至物镜最高分辨率的一半，但是衬度会降低。两束光使照射样品区域中的每一点在像平面上产生双束干涉。上述的光源，起偏器和产生O光线和E光线的DIC棱镜在样品（相位体）的下方，故图5-4均未画出。

图5-4 线性偏振和椭球偏振对光程差的响应

在没有样品（见图5-4（a））或不存在光程差（图5-4（b））时，每对光线的相干O波和E波在物体和图像之间具有同样的光程长度，即没有光程差；DIC棱镜把两个波合成一个线性偏振波，合成波的电场矢量振动平面与起偏器的透光轴平面是相同的，因此，合成波被检偏器消除，图像背景呈现暗黑，这种情况称为消光。

如果O光线和E光线对在物体上遇到相位梯度（见图5-4（c）），两个光束将具有光程差，因此在相位上有微小的位移。随后它们被DIC棱镜合成的波不是平面的，而是在三维空间呈现椭球轨迹。这些光线只能部分透过检偏器，形成小振幅的线性偏振光。由于它们是线性偏振的，振动平面是平行的，因此，它们在像平面干涉而形成物体的振幅图像。

从DIC棱镜出射的两个不同平面波阵面光线在成像平面相遇（见图5-5），每个波阵面显示出由样品中相位体引起的相位延迟。图5-5（a）中的相位图显示出仪器被调整到消光条件时，在成像平面中O波阵面和E波阵面重构时的波形。O波和E波都呈现出有一个波谷，它们的宽度表示了一个圆形物体的放大直径，它们的深度表示了相位（φ）延迟差。在两波干涉后，合成波可以用振幅（A）图表示（见图5-5（a））。从图5-5（a）的振幅图可知，球形物体的图像显示出一个中心暗的干涉条纹，两侧为明亮区。当背景也呈现暗时，整个效应是一个暗场成像。

在实际使用中，DIC棱镜通常不是调至在消光条件的位置。相反，棱镜位置的调整使零级干涉条纹位移至显微镜光轴的一侧，由此在O波和E波之间引入相位移，这种操作被称为偏置延迟的引入。由于位于背景的O光线和E光线具有微小的相位差，它们以椭圆偏振光从DIC棱镜出射，随后部分通过检偏器，从而背景呈灰色衬度而不是暗黑衬度。偏置延迟的引入使物体呈现出在灰色背景下暗黑的阴影和明亮强光构成的球形图像。这种三维立体感图像的出现正是由于在背景和球形界面处存在着相位梯度。物体边缘处的振幅相对于背景的振幅取决于O波阵面和E波阵面在样品上是相位延迟还是相位提前，不同情况会导致干涉条纹位移方向的变化。在某些显微镜中，偏置延迟是通过DIC棱镜位置来实现的。而在另一些显微镜中，DIC棱镜的位置是固定的，在光路中插入λ波晶片，偏置延迟是通过旋转起偏器来实现的。由DIC棱镜引起O波阵面和E波阵面之间的位移量是很小的，通常小于λ／10。偏置延迟的引入使物体更容易被看见，因为样品中的相位梯度被灰色背景下明暗衬度图形所表示出来。合成的图像呈现立体投影，即三维（浮凸）形貌，这正是DIC图像的显著特征。必须记住，与DIC图像中的样品浮凸形成对应的是相位梯度，而不是样品高度差引起的光程差。

图5-5 消光和偏置延迟条件下衬度的对比

自从DIC显微镜问世后，传统的相位显微镜不再流行，因为前者与后者具有相近的分辨率，但DIC显微镜具有更好的图像衬度和三维立体感。尽管如此，相位衬度的原理在光学显微镜中被广泛应用。