花椒素对皮肤的抗衰老作用

皮肤是人体最大的器官，它的衰老不仅影响美观，而且增加了多种皮肤疾病的发生。随着经济的发展和社会的进步，人们愈加重视外在形象，加上皮肤由于其浅表外露性所具有的较强的心理效应，延缓皮肤衰老成为人们关注的热点。以中草药天然成分为主的美容化妆产品，以其不良反应少、安全性高而受到消费者的青睐。

科学研究表明，皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白可以有效减少皱纹。皮肤毛囊的活性状态，直接影响皮肤的细腻、光滑。研究证实，花椒素WGX-50在动物组织水平上对皮肤（表皮、真皮及毛囊）有修复作用。同时也能延缓人皮肤成纤维细胞的衰老，保护其免受自由基的氧化损伤。花椒素WGX-50还可以调控与胶原蛋白有关的细胞因子，使皮肤年轻美观。

11.5.1 花椒素在组织水平延缓皮肤衰老

随机抽取7只16月龄小鼠，按单次药量0.3mg/kg体重，为小鼠涂抹花椒素WGX-50。同时，以相同浓度DMSO在小鼠对照用药部位给药。连续用药2周后，取小鼠相应部位皮肤，作冷冻切片。HE染色结果显示，经花椒素WGX-50用药后的皮肤，具有致密规整的真皮层，基底细胞繁多有序[见图11-26（a）、（b）]。皮肤组织冰冻切片的胶原蛋白免疫组织化学染色显示[见图11-26（c）、（d）]，经花椒素WGX-50用药后的皮肤，表皮层、真皮层及毛囊均有明显修复。

此外，借助Image J软件分析了切片真皮层胶原蛋白的分布密度，结果显示（见表11-8），经花椒素WGX-50用药后的皮肤，其真皮层胶原蛋白密度为（140.31±4.542）颗/mm2，相比对照组（120.25±5.539）颗/mm2有明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

以上实验证明，花椒素WGX-50可以在动物组织水平上延缓皮肤衰老。

图11-26 小鼠用药部位皮肤组织的冰冻切片HE染色（a，b）和胶原蛋白免疫组织化学染色（c，d）（彩图见第416页）

表11-8 皮肤真皮层胶原蛋白阳性颗粒密度/（颗/mm2）

11.5.2 花椒素通过NF-κB通路延缓皮肤衰老

在基因水平，衰老的发生多由基因调控。很多研究证实，大部分衰老相关基因都受到转录因子NF-κB的调节。NF-κB信号通路在生命体内有着关键的调控作用。文献报道，哺乳动物的衰老普遍与NF-κB有关。在人和小鼠的许多组织中， NF-κB是衰老发生的转录活化剂。已有研究表明，阻断皮肤组织中的NF-κB通路后，在基因水平和表型均发生了许多衰老特征的逆转。

对用药后的小鼠皮肤组织进行电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），结果显示对照皮肤组织中，有明显的NF-κB与寡核苷酸探针复合物滞后带[见图11-27（a）]。借助Image J软件分析NF-κB复合物滞后带灰度[见图11-27（b）]，发现花椒素WGX-50处理的皮肤组织中NF-κB复合物滞后带水平显著降低（P＜0.05）。提示花椒素WGX-50使NF-κB的结合活性降低，继而NF-κB通路的活化受到抑制。

为了探讨花椒素WGX-50抑制NF-κB结合活性的机制，提取小鼠给药部位皮肤组织浆蛋白，以看家基因（house-keeping gene）GADPH为内参，进行Westernblot实验。结果显示[见图11-27（c）]，对照组的p-IκB-α条带隐约可见，而实验组未见该条带。由于实验组GADPH条带明显强于对照组，因此经过GADPH校正的实验表明，花椒素WGX-50抑制了IκB-α的磷酸化，进而抑制了NF-κB的结合活性。

图11-27 （a）花椒素WGX-50对小鼠皮肤组织NF-κB活性的影响；（b）NF-κB滞后带的灰度分析图；（c）Westernblot分析WGX-50对皮肤组织中NF-κB通路的影响

11.5.3 花椒素在细胞水平延缓皮肤衰老

11.5.3.1 花椒素下调β-半乳糖苷酶活性

皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多种细胞因子是真皮组织的主要细胞，因而与细胞的衰老息息相关。β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是一种细胞衰老的特异性标志物（biomarker），细胞衰老时β-半乳糖苷酶活性水平上调。在普通光学显微镜下，对染色的衰老细胞或组织进行观测，依据细胞被染成蓝色的深度判断细胞衰老的程度。过氧化氢作为一种氧化剂，可以诱发细胞衰老。

对纯度高且长势良好的人皮肤成纤维细胞分别做如下药物处理：花椒素WGX-50处理、过氧化氢处理、过氧化氢处理后用花椒素WGX-50处理、WGX-50处理后用过氧化氢处理，同时设立对照组（见图11-28）。

实验结果显示，花椒素WGX-50不会引起细胞衰老[见图11-28（c）]；过氧化氢处理后细胞被染成蓝色[见图11-28（d）]，即诱发了细胞衰老，进而产生了衰老的特异性标志物β-半乳糖苷酶。再辅以花椒素WGX-50处理后，细胞中β-半乳糖苷酶明显减少[见图11-28（e）]，即显著延缓了细胞衰老。先用花椒素WGX-50处理细胞，再辅以过氧化氢处理后，细胞中β-半乳糖苷酶明显少于过氧化氢处理组[见图11-28（f）]，也少于过氧化氢处理后辅以花椒素WGX-50处理组。以上结果提示花椒素WGX-50对细胞具有抗衰老作用。

图11-28 β-半乳糖苷酶染色法研究花椒素WGX-50对人皮肤成纤维细胞衰老的影响（彩图见第416页）

（a）人皮肤成纤维细胞；（b）空白对照；（c）WGX-50处理；（d）H2O2处理；（e）H2O2处理后加WGX-50；（f）WGX-50处理后加H2O2

11.5.3.2 花椒素抑制老年斑的形成

机体代谢产生的自由基具有极强的氧化能力，它可将生物膜中的不饱和脂类氧化成过氧化脂质。过氧化脂质分解产生的丙二醛（MDA）又是一种强力交联剂，它能与蛋白质、肽和脂类聚合交联，形成老年色素或脂褐质。这种色素不能排出体外，于是沉积在细胞体上形成老年斑。需说明，这里的老年斑与淀粉样蛋白级联假说所指的老年斑不同。

以细胞的MDA分泌量指示老年斑水平，分别以花椒素WGX-50（1μmol/L）、花椒素WGX-50辅以过氧化氢、过氧化氢对人皮肤成纤维细胞进行药物处理，同时设立对照组。实验结果表明，花椒素WGX-50在细胞水平抑制了MDA的产生（见图11-29），即可抑制因自由基堆积引起的细胞氧化损伤、减少老年斑的形成。

图11-29 花椒素WGX-50对细胞分泌的MDA水平的影响

11.5.3.3 花椒素调控细胞TGF-β的水平

TGF-β对细胞的分裂、增殖和迁移有重要作用。在人皮肤成纤维细胞中， TGF-β还可以通过抑制胶原酶的产生阻断胶原蛋白的分解。用花椒素WGX-50处理皮肤成纤维细胞的第2天，细胞分泌的TGF-β水平显著提高，到第3天TGF-β又恢复到原有水平（见图11-30）。以上说明，花椒素WGX-50可在一定时间内有效调控TGF-β的分泌，从而提高皮肤中胶原蛋白的表达量。

图11-30 花椒素WGX-50调控细胞内TGF-β的分泌